DB44/T1136—2013 饲料中乳酸菌活菌的检验方法
发布：2013-05-08
实施：2013-08-15
广东省质量技术监督局

本标准按照GB/T1.1—2009起草，附录A为规范性附录。本标准由广东省质量技术监督局提出，起草单位为广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心）。主要起草人包括朱红惠、羊宋贞、冯广达、李燕旋、王永红、张鲜姣、邓名荣。

1 范围
本标准规定了含乳酸菌饲料中乳酸菌（肠球菌、乳杆菌、片球菌）活菌的微生物学检验方法，适用于相关饲料中乳酸菌活菌的检验。

2 规范性引用文件
GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T14699.1 饲料采样

3 设备和材料
3.1 恒温培养箱：36℃±1℃
3.2 厌氧培养装置
3.3 均质器及无菌均质袋、均质杯或灭菌乳钵
3.4 天平：感量0.01g
3.5 光学显微镜：1000倍
3.6 无菌培养皿：直径90mm；试管：18mm×180mm
3.7 广口瓶或三角烧瓶：容量100mL、250mL、500mL、1000mL
3.8 无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头
3.9 其他微生物实验室常规灭菌及培养设备

4 培养基和试剂
4.1 实验室用水应符合GB/T6682三级用水要求
4.2 0.85%灭菌生理盐水
4.3 MRS培养基（附录A.1）
4.4 肠球菌琼脂（胆汁七叶苷叠氮钠琼脂）（附录A.2）
4.5 革兰氏染色液（附录A.3）

5 试样制备
5.1 饲料采样和试样制备按GB/T14699.1执行
5.2 采样应在无菌操作下进行
5.3 采样工具（铲子、匙、采样器、试管、广口瓶、剪子等）应无菌
5.4 样品包装为袋、瓶或罐装者，取完整未开封的；固体样品应边取边混合，流体样品通过振摇混匀

6 检验程序
样品25g（或25mL）加225mL无菌生理盐水，进行10倍系列稀释，选择3个适宜稀释度，每个稀释度吸取0.1mL加入MRS平板涂布，厌氧条件下36℃±1℃培养48h±2h进行乳酸菌总数计数。乳杆菌计数同理，在肠球菌琼脂培养基EA平板涂布，随机挑取5个菌落镜检后计算比例。肠球菌计数完成后，片球菌数=乳酸菌总数-（肠球菌数+乳杆菌数）。可选操作：挑取乳酸菌（乳杆菌、片球菌和肠球菌）接种于MRS琼脂培养基进行菌种鉴定。

7 操作步骤
7.1 冷冻样品可在2℃～5℃解冻不超过18h，或在≤45℃解冻不超过15min
7.2 固体和半固体样品：称取25g样品于装有225mL 0.85%无菌生理盐水的无菌均质杯，8000～10000r/min均质1～2min，制成1:10样品匀液；或置于225mL 0.85%无菌生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1～2min制成1:10匀液
7.3 液体样品：摇匀后以无菌吸管取25mL加入225mL 0.85%无菌生理盐水的无菌锥形瓶中振摇，制成1:10匀液
7.4 用1mL无菌吸管或微量移液器取1mL 1:10匀液注入装有9mL 0.85%无菌生理盐水的无菌试管中，充分振摇，制成1:100匀液
7.5 按相同步骤进行10倍递增稀释，每次换用新的无菌吸管或吸头
7.6 乳酸菌计数
7.6.1 乳酸菌总数：选择2～3个适宜稀释度，每个稀释梯度两块平板，吸取0.1mL稀释液于MRS琼脂平板，用L形涂布棒涂布进行培养