牛乳中A2型β-酪蛋白（A2奶）鉴别技术规程 本文件根据GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》起草，由天津市农业农村委员会提出并归口，起草单位为天津市农业科学院。主要起草人包括马毅、谭冬飞、陈丽丽、赵康、张漫、芦娜、王丽学。 1. 范围 本文件规定了牛乳中A2型β-酪蛋白（A2奶）的检测原理、主要试剂配制、主要仪器设备、质谱检测及数据处理参数、检测方法、结果判定、废弃物的处理及检测过程中防止交叉污染的措施。本文件适用于牛奶和奶粉中A2型β-酪蛋白（A2奶）的检测。 2. 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。凡是注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有修改单）适用于本文件。 - GB/T6682 分析实验室用水规格和实验方法 - GB/T19495.2 转基因产品检测实验室技术要求 3. 术语和定义 3.1 A2型β-酪蛋白 A2型β-酪蛋白是由209个氨基酸组成，其一级序列中的第67位氨基酸为脯氨酸（Proline，P）时，称为A2型β-酪蛋白。 3.2 A2奶 A2奶指的是所含β-酪蛋白为A2型的牛奶。 3.3 质荷比 质荷比（mass-to-charge ratio）表示离子的质量与其所带的电荷数之比，用/z表示。 4. 检测原理 β-酪蛋白变体型的氨基酸突变位点为第67位组氨酸（Histidine，H）突变为脯氨酸（Proline，P），这导致分子量发生差异。利用质谱分析技术，可以根据不同突变体型的分子量和质荷比差异识别样品中的肽段，进而确定氨基酸突变位点。 5. 试剂配制 实验所用水应符合GB/T6682规定的一级水。高压灭菌条件为121℃，1.034×10^5 Pa压力，蒸汽灭菌20分钟。 常用试剂配制如下： - 样品裂解液：将480.4g尿素，7.1gHEPES溶于800mL蒸馏水中，充分溶解后，定容至1L。 - 10% SDS（十二烷基硫酸钠）：将10gSDS粉末溶于80mL蒸馏水中，加热至68℃助溶，用HCl调pH至7.2，定容至1000mL，过滤并高压灭菌。 - 30% 丙烯酰胺：将29g丙烯酰胺和1gN，N-亚甲双丙烯酰胺溶于60mL蒸馏水中，定容至100mL。 6. 仪器设备 6.1 单道可调移液器 范围：0.25~2.5μL, 1~10μL, 2~20μL, 5~50μL, 10~100μL, 20~200μL, 100~1000μL。 6.2 10K超滤管 截留蛋白分子量：30~90KDa。 6.3 离心机 最高转速12000rpm，最大容量24×1.5mL。 6.4 电子天平 精度：万分之一。 6.5 凝胶成像分析系统 分辨率：1280×1024，灵敏度：DNA ≥6.6。 6.6 稳压稳流电泳仪 输出电压：0~600V，输出电流：0~100mA。 6.7 垂直电泳槽 外形尺寸：15cm×12cm×13cm，凝胶板面积：10cm×10cm。 6.8 高压灭菌锅