ICS 65.150
CCS B 52

DB32
江苏省地方标准
DB32/T 4727—2024

鳅鱼传染性脾肾坏死病诊断及综合防控技术规程
Technical code of practice for the diagnosis, prevention, and control of infectious spleen and kidney necrosis in mandarin fish

2024-04-03 发布
2024-05-03 实施
江苏省市场监督管理局 发布
中国标准出版社 出版

前言
本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由江苏省农业农村厅提出，本文件由江苏省渔业标准化技术委员会归口。
本文件起草单位：扬州大学。
本文件主要起草人：张晓君、高晓建、姜群、刘晓丹、朱鑫海、姜姿妍、周一凡。

1 范围
本文件规定了鳅鱼传染性脾肾坏死病的诊断、综合防控和记录。
本文件适用于鳅鱼传染性脾肾坏死病毒的检测以及鳅鱼传染性脾肾坏死病的诊断和综合防控。

2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB 11607 渔业水质标准
SC/T 7103 水生动物产地检疫采样技术规范

3 术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。

4 诊断

4.1 现场调查
水质情况包括水温、水色、透明度、pH、亚硝酸盐、氨氮、溶解氧、硬度等；养殖情况包括养殖密度、苗种来源、饵料鱼来源等。

4.2 临床诊断
患病鳅鱼表现为沿池边漫游而死，鳃盖、口裂周围、下颌、胸鳍、腹鳍充血，鳃发白。解剖后肝脏呈现白色或有出血点，肾脏和脾脏肿大或有明显的出血点，胆囊囊肿大，部分幽门盲囊出血（见附录 A 图 A.1）。

4.3 检测方法

4.3.1 试剂材料
试剂材料包括：
a) 无水乙醇（分析纯）；
b) 三氯甲烷（分析纯）；
c) 异戊醇（分析纯）；
d) 1 mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA），pH 8.0；
e) 1% 十二烷基硫酸钠（SDS）；
f) ddH₂O；
g) 10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，4℃ 保存；
h) Tris 饱和酚，4℃ 保存；
i) 8 U/μL Bst DNA 聚合酶，-20℃ 保存；
j) 10 mmol/L dNTPs 混合物（dATP、dTTP、dCTP、dGTP 各 2.5 mmol/L），-20℃ 保存；
k) 10000× SYBR Green I，-20℃ 保存；
l) 25 mmol/L MgCl₂，-20℃ 保存；
m) 10× LAMP 缓冲液，-20℃ 保存；
n) 5 mol/L 甜菜碱，-20℃ 保存；
o) 10× PCR 缓冲液，-20℃ 保存；
p) 5 U/μL Taq DNA 聚合酶，-20℃ 保存；
q) 20 mg/mL 蛋白酶 K，-20℃ 保存；
r) LAMP 检测引物序列：
F3: 5'-AACCACCAGGCAGAAATGG-3'
B3: 5'-ATCCGAGGCGACGTCATC-3'
FIP: 5'-TAAAGCCAAAGCCCACATCGGCGAAGACATGGTGCGCTACT-3'
BIP: 5'-AAGCAAGTGCACAGCACCCGTCAAGCCTCGCACAGAGG-3'
s) 巢式 PCR 检测引物序列：
MCP-F1: 5'-ATGTCTGCAATCTCAGGT-3'
MCP-R1: 5'-TTACAGGATAGGGAAGCCTG-3'
MCP-F2: 5'-GCGTTTGATGCGATGGAGAC-3'
MCP-R2: 5'-ACGGCAGAGACACGGTAGGC-3'

4.3.2 仪器设备
仪器设备包括：
a) 灭菌锅；
b) 水浴锅；
c) PCR 仪；
d) 紫外分光光度计；
e) 电泳仪；
f) 电泳槽；
g) 凝胶成像系统；
h) 离心机。

4.3.3 采样
采集病鱼肾脏、脾脏、肝脏，匀浆后用于 DNA 提取。

4.3.4 检测样本模板制备
利用酚-氯仿（三氯甲烷）法抽提混合组织 DNA。每个样品取组织 100 mg~200 mg，匀浆后置于 1.5 mL 微量离心管，加入含蛋白酶 K 的裂解液（10 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0；1 mmol/L EDTA, pH 8.0；1% SDS），60℃ 消化 1 h~3 h。
用 Tris 饱和酚：三氯甲烷：异戊醇（25：24：1）混合液提取、纯化 DNA，-20℃ 冷冻的无水乙醇沉淀 DNA，自然干燥，溶于灭菌 ddH₂O。紫外分光光度计测定 DNA 浓度和纯度，琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 完整性。DNA 样品置于 -20℃ 冰箱保存备用。

4.3.5 环介导等温扩增（LAMP）检测方法

4.3.5.1 LAMP 扩增
按表 1 加入各项试剂进行 LAMP 扩增，同时以 ddH₂O 为模板作阴性对照，以病毒质粒作阳性对照。LAMP 的反应条件：65℃ 保持 60 min，80℃ 终止反应 10 min。

表 1 LAMP 反应体系（25 μL）
试剂：DNA 模板；内引物（FIP、BIP）；外引物（F3、B3）；dNTPs (10 mmol/L)；10× LAMP 缓冲液；甜菜碱 (5 mol/L)；MgCl₂ (25 mmol/L)；Bst DNA 聚合酶 (8 U/μL)；ddH₂O。
体积：2 μL；各 1 μL；各 1 μL；2.5 μL；2.5 μL；4 μL；2 μL；1 μL；补足至 25 μL。

4.3.5.2 LAMP 检测结果判断
将 1 μL 10000× SYBR Green I 荧光染料加入 LAMP 反应产物，振荡后观察混合液颜色，绿色为阳性，橙色为阴性（见图 A.2）。

4.3.6 巢式 PCR 检测方法

4.3.6.1 PCR 扩增
按表 2 加入试剂进行第一轮 PCR 扩增，同时以 ddH₂O 为模板作阴性对照，以病毒质粒作阳性对照。PCR 的反应条件：94℃ 预变性 5 min、94℃ 变性 30 s、58℃ 退火 30 s、72℃ 延伸 1 min，循环 30 次后 72℃ 延伸 10 min。

表 2 第一轮扩增反应体系（25 μL）
试剂：DNA 模板；MCP-F1；MCP-R1；10× PCR 缓冲液。
体积：0.5 μL；0.5 μL；0.5 μL；2.5 μL；3 μL（注：此处原文数据可能存在排版错位，依据常规体系推测后续应有其余试剂及ddH₂O补足，此处仅保留OCR识别到的明确对应关系，实际应用中需参照完整标准原文核对完整表格数据）。