本标准规定了化学品细菌回复突变试验的范围、术语和定义、试验基本原则、试验方法、试验数据和报告。适用于检测化学品的致突变性。 本标准等同采用经济合作与发展组织( OECD)化学品测试指南 No.471(1997年)《细菌回复突变试验》(英文版)。本标准作了以下编辑性修改：———增加了范围部分；———计量单位改成我国法定计量单位；———删除了ＯＥＣＤ 的参考文献部分。 GB/T 21786-2008 化学品 细菌回复突变试验方法 GB/T21786-2008 标准下载解压密码：www.bzxz.net
本标准规定了化学品细菌回复突变试验的范围、术语和定义、试验基本原则、试验方法、试验数据和报告。适用于检测化学品的致突变性。 本标准等同采用经济合作与发展组织（ OECD）化学品测试指南 No.471（1997年）《细菌回复突变试验》（英文版）。 本标准作了以下编辑性修改： ———增加了范围部分； ———计量单位改成我国法定计量单位； ———删除了ＯＥＣＤ 的参考文献部分。
本标准等同采用经济合作与发展组织（ＯＥＣＤ）化学品测试指南Ｎｏ．４７１（１９９７年）《细菌回复突变试验》（英文版）。
本标准作了以下编辑性修改：
---增加了范围部分；
---计量单位改成我国法定计量单位；
---删除了ＯＥＣＤ 的参考文献部分。
本标准由全国危险化学品管理标准化技术委员会（ＳＡＣ／ＴＣ２５１）提出并归口。
本标准负责起草单位：中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所。
本标准参加起草单位：北京市疾病预防控制中心、宁波出入境检验检疫局。
本标准主要起草人：邓瑛、穆啸群、吴维皑、赵超英、龙再浩。

IcS13.300:11.100
中华人民共和国国家标准
GB/T21786—2008
化学品
细菌回复突变试验方法
Chemicals-Test method of bacterial reverse mutation2008-05-12发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2008-09-01实施
GB/T21786—2008
本标准等同采用经济合作与发展组织（0ECD）化学品测试指南No.471（1997年）《细菌回复突变试验(英文版)。
本标准作了以下编辑性修改：
一增加了范围部分；
：一计量单位改成我国法定计量单位：删除了OECD的参考文献部分。
本标准由全国危险化学品管理标准化技术委员会(SAC/TC251)提山并归口。本标准负责起草单位：中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所。本标雁参加起悼单位：北京市疾病预防控制中心，宁波出人境检验检疫局：本标准主要起草人：邓瑛、穆群、吴维、赵超英，龙再浩。1
GB/T21786—2008
OECD引言
1.细菌回复突变试验应用需要氨基酸的鼠伤寒沙门氏菌（SaimunellaTyphimuritm）和大肠杆菌(Escherichia coti)菌株去检测由DNA的一个或数个碱基对的置换、增加或缺失造成的点突变。本试验的原理是检测诚验株中存在的回复突变并恢复合成必需氨基酸的能力。发生回复突变的缅菌能在缺乏特定必需氨基酸的条件下生长，而亲代菌株则不能生长，放能检出。当营养缺陷型菌在受试样品作用下发生回复突变后，即恢复了合成特定氮基酸的能力，齿此可以在不含该氮基酸的培养基[:形成菌落·而那些没有发生突变的菌株和奕变菌株的亲代菌侏则因无法合成特定氨基酸而不能在不含该氮基酸的培养基上形成菌落，
2．点窦变是人类的狠多遗传性疾病的原因，而且，前口有充足的证据证明，人和实验动物体细胞的癌基因和抑瘤基齿的点突变与肿瘤发生有关。细菌回复突变试验具有快速、经济和操作相对简便等优点。很多试验菌株还具有些特征，使其对某类致突变物更加敏感，这些特征包括回复突变位点的应答性DNA序列、细胞对大分了物质的通透性增高以及D:NA修复系统的消涂(缺失)或DNA 易错修复增多等，通过特异性菌株获得的试验结果可为遗传毒性物质诱发的突变类型提供有价值的研究资料。已立了包含大母不筒结构化学物的细菌同复突整诚验结果的数据库，可以从中得到所需资料，同时，还为测试不同理化性质的化学物(例如可对挥发性物质)建立了完善的方法。3、细菌恢复突变试验应用的是原核细胞，其在吸收、代谢、染色体结构、DNA修复过程等方面与哺乳动物细胞都有差别。且本试验是体外试验：一般需要而人外源性代谢活化系统。旧外源性代谢活化系统不能完全模拟体内代谢条件，因此，本试验的结果不能为受试样品对乳动物的致突变性和致癌性提供直接证据。
4，细菌回复突变试验通常作为遗传毒性初筛试验，儿其适用于对受试样品诱发点突变能力的检测。大量研究数据表明，很多在本试验小获得阳性结果的化学物在其他试验中也具有致妄变活性。但也有一些致突变剂在本试验中（结果）为阴性的例子，本试验存在这种缺陷可能是山于检测终点的特殊性质，代谢活化过程不同以及生物利用度的差异等原因造成的。另一方面，一些使本试验灵敏度增加的因素他会造成对致突变活性估计过高。5．细菌回复试验不适合评价某些类型的化学物，例如，具有较强杀菌作用的化合物（如某些抗生素）、认为或已知对哺乳动物细胞复制过程有特异性干扰作用的化合物（如拓扑异构酶抑制剂、核苷酸类似物等），这些物质选用哺乳动物的致突变试验更合适。6．尽管很多在本试验中获得阳性结果的化学品是哺乳动物的致癌物，但这种相关性并不是绝对的，而是与化学物的种类有关。还有一些致癌物不能用本试验检出，因为这些物质是通过其他的、非遗传致癌机制或受试菌株不具备(存在)的机制引发癌症的。1范围
化学品细菌回突变试验方法
GB/T 21786—2008
本标推规定了化学品细菌回复突变试验的范围、术语和定义，试验基本原则、试验方祛、试验数据和报告。
本标难适用于检测化学品（有茶菌作用的除外)的致究变性。2术语和定义
下列定义和术语适用于本标准。2.1
reverse mutation test
回复突变试验
在鼠伤寒钞门氏菌(xulmonellatyphimuriun）或大肠杆菌（escherichia coli)中检测需要氨基酸菌株(分别为组氨酸和色氮酸)的窦变，以产生-株不依赖外界提供氨基酸的菌株。2.2
碱基对置换突变剂base pair substitntion mutagens能够引起DNA碱基改变的物质。在回变试验中，这种改变可发生在原发突变位点，在细菌基因组中也可在第二位点发生突变。
移码窦变剂frameshiftmoLagens能整引起DNA中单个或多个碱基对的增加或缺失，继而改变了RVA的读码框的物质。3试验基本原则
3.1细菌悬液分别在加人或不加人外源性代谢活化系统的条件下与受试样品接触，在平血掺人试验中，将上述混合物与顶层琼脂充分滤匀，迅速倾人底层琼脂平板（最低营养琼脂）上。在预孵育试验中，先将细菌悬液与受试样品混合进行预孵育，然后再与顶层琼脂充分混勾，迅速倾人底层琼脂平板（最低营养琼脂)上。上述平肌培养2d~3d后，计数回复菌落数并与溶剂对照组的自发回复菌落数进行比较。
3.2细菌回复突变试验有数种操作方法，其中最常用的是平血参人法、预孵育法、震荡培养法和悬浮培养法等。还有用于检测气体乾蒸气的改良方法。3.3本标准所描述的主要是平血掺人法和预孵育法：这两种方法在圳人或不加人代谢活化系统的条件下都能进行。有些化学品用预孵育法更有效，包括短链脂族亚硝胺，二价金属、醛类、偶氮染料和重氮化合物、丁坚光生物碱、烯丙基化合物和硝基化合物。在研究中还发现某些类别的化学品用标准的方法，如平瓜掺人法和预孵育法并非总能检山阳性结果，这种情况应视作“特例”，并强烈建议采用其他替代试验程序进行检测。在文献中，已用替代方法对下列“特例”的致突变性进行了鉴定（同时提供了所用试验程序的例子），“特例”一般包括偶氮染料和重氮化合物，气态或挥发性物质和葡萄糖古等。对标准方法的改动应有科学侬据，
4试验方法
4.1试验准备
4.1.1细菌
4.T.1.1新鲜的细菌培养物应生长至指数生长晚期或稳定期早期（细菌浓度药为10个/mL),生长已1
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达稳定期晚期的培养物不能使用。试验中所用的培养物中的活菌滴度应较高。活菌滴度可根据细菌生长曲线的所史性对照数据确定，或在每次试验时通过滴片测定活菌数。4.1.1.2推荐的培养温度：37
4.1.1.3牟少应用5种菌株，包括4个鼠伤寒沙门氏菌（TAL535；TA1537或TA97a或TA97TA98和TA100)，对这些菌探的检测结果可靠且不同实验室之间有较好的虽现性，这四种菌株在初始回复突变位点有GC碱基对，已知它们不能检测某些氧化型致窦变物、DNA交联剂和耕类物质。检测这些物质应选用在切始回复突变位点有AT减基对的大肠杆菌WP2菌株或鼠伤寒沙门氏菌TA102菌株。因此，推荐的菌株组合方案如下：鼠伤寒沙门氏菌TA1535和
鼠伤寒沙门氏菌TA1537或TA97或TA97a和鼠寒沙门氏谢TA98和
鼠竹寒沙门氏蘭TAO和
大肠杆菌WP2uvrA或杆菌WP2uvrA(pKM101)或鼠伤寒沙门氏菌A102关，最好用鼠伤寒沙门氏菌TA1Q2或加一种#长修复DNA的大肠杆菌为检测 DNA交联
WP2uVIA或大肠杆首WPuvrA(PKMIO1）作为受式菌株之—4. 1. 1. 4应按已建
耀作规程对菌种的培养制品进行保存和标记鉴别。每次复苏冻存菌种的培养制品时均应进行氨基酸棉求试验（鼠伤寒沙门氏菌需要组氨酸，大肠杆菌需要色氨酸）同样，还应进行
其他的表型鉴定，包括有无R因子重粒［即，TA98，TA100和TA97a或 TA97, VP2
VIA, WP2 UVIA
（pKM101)菌株对C青综素的抗性，以及TA102对氨作青塞赢和四环素的抗性门和特征性突变的存C菌的rIa突变使真对结晶紫敏感-大肠杆菌的uvIA突变和眼寒沙门氏荫的在（例如：鼠伤寒沙
外敏感）。这些菌株会产生自发回变，通过平板记数获得自发回变数应在历史对uvrB 突变使其对
十在文献报道的范用内
照数据范围内，最！
4.1.2培养基
应用适宜的最低营养琼脂（含ogel-Bonner最低培养基E和需糖）利含有组氨酸和生物素或色氨酸的项层琼脂，以
4. 1. 3代谢活化
数细胞完成数次分裂
细菌应在有或无适谢活化系统的条件下与受试样品接触。最常用的活化系统是经酶诱导剂处理的，从啮齿类动物肝脏命备的加有辅助因子的后线粒体组分（s9），所用的酶锈导剂包括Aruclor1251或苯巴比妥和β素黄配会诱导。带用的后线粒体组分液度范图是59混液5%～30%（体积分数）。应根据受试样品的类别选护代谢活化系统及其应用条件。在某些情况下可使用一种以上浓度的S9，对于偶氮染料或重氮化骨物选越还原性代谢活化系统。4，1.4受试样品/准备
在对菌株进行处理前，固体受试样品应该溶解或混悬于合适的潜剂或赋形剂中，如需要可进行适度稀释，液体受试样品可直接加入测定体系或在处理前适度稀释。受试样品应新鲜制备，否则需有资料证明其贮存的稳定性。
4.2试验条件
4. 2. 1溶剂/赋形剂
溶剂/赋形剂不应与受试样品发生化学反应，且对细菌的存活和S9的活性无影响。若选用的不是常用的溶剂或赋形剂体，应有资料提供适合的理由。能用水作溶剂或赋形剂的，应首先考虑以水作为溶剂或赋形剂，如爱试样品对水不稳定，应选用不含水的有机落剂或赋剂。4. 2. 2 染毒剂量
4.2.2.1成根据受试样品对细菌的毒性和在配制的最终混合物中的溶解度确定受试样品所用的最高浓度。建议先进行预试验测定受试样品的毒性和溶解度。可将回变菌落数的减少、背景菌苔体积变小、2
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或处理后细菌存活率降低等作为细胞跑蒂性的指征。代谢活化系统的存在可改变受试样品的毒性。在实际试验条件下，最终混合物出现肉眼可见的沉淀即判断为不溶。对无细胞毒性的可溶受试样品，建议最高试验浓度应为5mg/m或5μL/m，对无细胞毒性但溶解度达不到5mg/Ⅲ或5uL/血的受试伴品，在最终处理混合物应有个或多个浓度出现沉淀现象。在低于5mg/血或5μL/Ⅲ时即出现细胞毒性的受试样品，最高浓度应达到出现细胞毒性的浓度。沉淀不应影响结果计数。4.2.2.2率少应选用5个可供分析的试验浓度。在开始试验时，剂量间隔一般为半对数（例如V10），在研究剂量-反应关系时也可以采用更小的剂量间隔。4.2.2.3如果变试样品含有可能具有致突变作用的系质试验浓度可超过5mg/m或5μL/血。4.2.3对照
4.2.3.1每次试验均应设置同时进行的阳性和阴性（落剂或赋形剂对照，且应在有或无代谢否化系统的条件下分别设置。加入优谢活化系统时，每一次试验选用的阳性物浓度应能证明试验的有效性。4.2.3.2为检验所用的代谢活化系统，应根据试验菌株类型选择适宜的阳性物，下列化学品是适合进行代谢活化试验的阳性物
9,0-二甲基葱methylanthracene[CASNO.781-43
7,12-二甲基苯
刚果红 Cong
2-dinethylbenzanthracene[CASNo.57-97-6][CASNa
pyrene
573-58-07
环畴酰胺（单水）yclophosphamide50-32-8 7
monohydrate】 [GAsNo.www.bzxz.net
50-18-0(CA Sno. 6055-19-2))
Linoanthracene[CASNe.613-13-82-氨基总酶
2-氮基葱醒能单独作为评价S9混童物活性的指示剂，如果选用它作为阳性物对雄批S9还应另选一种需要微粒体高代谢活化的致突变物证实其活性，如苯并。逆或二甲基苯葱。4.2.3.3对不加代时活化系统的试验各菌株特异性的阳性对照物见表1表
学品名称及
CAS编号
SNo.26628-22-81
老氮钠 sodiun B8ic
2-硝基萄2-nitrafluc
ASNo.607-57-81
g-每燕丫啶9-aminoacdineASNo
ICR191[CASn0, 17C70-
异内基苯过氧化氢 cuniene
droren
各菌株特异性对照物表
Ta535#TA100
45-9或
xide ICASNo. 80-15-9 J
丝裂霉素 C nitoroyin CrCAS0-0N-Z基 N-硝基 N 亚硝基胍 N ethylN nitru N-nilrsoguartidine[CASNa，70-25-7二或4-硝基唑琳1氧化勒nitroquinoline1-oxide[CASno. 56-57-5 ]
随糠颜胺furyifuramide（AF-2)[C.ASNo.3588-53-7]TA1537TA97和TA97
WP2urA和TA102
WP2.WP2uvIA和WP2uVIA(PKMI0l)含质粒的菌株
4.2.3.4也可以使用其他适合的阳性物，如可能，可考虑使用化学类别相关的阳性对照物，4.2.3.5阴性对照在每次试验时除在试验培养基中只加入猝剂或载休体外，其余处理应与各处理组相同。另外，如果没有历史数据证明所用资剂或裁体无毒性作用或致突变作用，还应设空白对照组（不进行任何处理）。
4.3试验步骤
4.3.1受试样品处理
4.3.1.1平Ⅲ掺人法：不需代谢活化时,通常将 0.05mL或0.1mL受试样品溶液、0.1mL新鲜的细3
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菌培养液(含108个细菌)和 0.5 mL灭菌缓冲液与 2. 0 mL 顶层琼脂混合。如需代谢活化系统条件下，通常将0.5mL含适显后线粒体组分（体积约占代谢活化混合液总量的5%～30%）的代谢活化混合物与细菌和受试物/受试溶液一起与顶层琼脂混合，将上述混合液充分混合后例在最低营养琼脂上，待项层琼脂凝固后放人培养箱培养4.3.1.2预孵育法，将受试物/受试落液与受试菌株（约含10°个细菌）和灭菌缓冲液或代谢活化系统(0.5mL)在30℃~37℃预孵育20 min或更长时间，再与项层琼脂混合，然后倒在最低营养琼脂上。通常用 0. 05 mL. 或 0. 1 mI. 受试物/受试溶液,0. 1 ml. 菌液，0. 5 mLS9 混合物或灭菌缓冲液,与 2. 0 mL项层琼脂混合。在预孵育过程中应将试管放人震荡器中囊荡充气。4.3.1.3为了评价结果的变异度，每个剂量水平应做三个平行平板，如有科学的理由也可做两个平行平板，偶尔丢失-个平血的数据不影响结果的可靠性。4.3.1.4气态或挥发性物质应采用适当方式测试，例如在封闭的培养血中进行。4.3.2培养
将试验中的所有平血置于37℃培养48h~72h：培养结束后计数每个平血的向复突变菌落数。5试验数据和报告
5.1数据处理
5.1.1应列出每个平血的回复爽变菌落数。阴性对照(溶剂对照,有时还有空白对照)和阳性对照组各血的回复窦变菌落数也应记求。5.1.2应列出受试样品各组、阴性对照和阳性对照的每血回复突变菌落数、平均回复突变菌落数和标准荐。
5.1.3对明确的阳性结果无需进行验证试验。可疑结果最好通过改进试验条件进一步试验来澄清。阴性结果需视其体情况决定。如认为阴性结果无需进行验证试验，应说明理由。在随后的试验中应改进试验参数以扩大评价条件范围，改进的参数包括浓度间距，处理方法(平血参人或溶液预孵育等)和代谢活化条件。
5.2结果评价和解释
5.2、1阳性结果判定有几个标准。如受试样品各组回复突变菌落数的增加呈剂益-反应关系，或至少有一个菌株在有或无代谢活化系统条件下，在个或几个剂量水平每血回复突变菌落数出现可重复的增加。应首先考虑结果的生物学意义。统计学方法可用于帮助评价试验结果，但不能作为阳性反应判定的唯-网素：
5.2.2不符合以上标准的受试样品则被认为在本试验中无致突变性。5.2.3尽管多数试验都能给山明确的阳性或阴性的结果，但也不排外极少数试验不能对受试样品活性做出明确判断例如，无论重复试验多少次，结果仍模棱两可或可疑。5.2.4细菌回复突变试验的阳性结果表明受试样品可引起所用鼠伤寒沙门氏菌或大肠杆菌的基因组发生碱基置换或移码突变诱发的点突变。可重复的的浓度-反应关系意义较大。阴性结果表明在本试验条件下受试样品不引起试验菌株的窦变。5.3试验报告
试验报告应包括以下信息：
5. 3.1受试样品
a）名称和识别码如CAS编号（如已知)；b)
物现性质和纯度；
与试验实施相关的物理化学特性；d)
受试样品稳定性(如了解)。
落剂/赋形剂
选择裕剂/赋形剂的理由：
受试样品在溶剂/赋形剂中的溶解性和稳定性（如了解）。细菌
所用菌株：
每血址入的细荫数；
菌株特征。
试验条件
CB/T21786—2008
每血加受试样品的量(mg/而或μg/血),剂显选择的依据，每个度的平血数;选用的培养基；
代谢活化系统的类型和成分，包括判断可接受的标准：处理过程。
萨性表现；
沉淀现象；
每个平血的菌游计数；
每Ⅲ平均回变菌落数和标推差，剂量-反应关系(如可能）
统计学分析(如有)：
同期阴性（辫剂/赋形剂）和阳性对照数据（包括数据范围、与数和标准差）历史性的阴性(溶剂//赋形剂)和阳性对照资料(包括范围，均数，标准差)。结果讨论。
结论。
GB/T 21786-2008
中华人民共和国　
国家标准
细菌回复窦变试验方法
GB/T 21786—2002
中闵标准出版社出版发行
北京复兴门外三里河北街1.6号
邮政编码：100045
网址 spc.net.cn
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开本 880×1230 1/16
印张0.75字数13千
2008年7月第版
2008年7月第一次印刷
书号：1550661-32187定价14.00元由本社发行中心调换
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