本标准规定了牛尿中玉米赤霉醇、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚残留量液相色谱-串联质谱测定方法。本标准适用于牛尿中玉米赤霉醇、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚残留量的测定。 GB/T 20767-2006 牛尿中玉米赤霉醇、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 GB/T20767-2006 标准下载解压密码：www.bzxz.net

ICS 67. 050
中华人民共和国国家标准
GB/T20767—2006
牛尿中玉米赤霉醇、已烯雌酚、已烷雌酚、双烯雌酚残留量的测定液相色谱-串联质谱法
Method for determination of zcaralanol, diethylstilbestrol.hexestrol and dicnocstrol multi-residues in bovine urinc-LC-MS-MS method
2006-12-31发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2007-03-01实施
本标准的附录A和附录B为资料性附录，木标准由中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局提出。本标准由中华人民共和国国家质量临督检验检疫总局归几GB/T20767—2006
本标准起草单位：中华人民共和国杂皇岛山人境检验检疫局、中华人民共和国天津出人境检验检疫局。
本标准主要起草人：庞国芳、许泓、林安清、古陇、何佳、张曼，本标准系首次发布的国家标准、1
1范围
牛尿中玉米赤霉醇、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚残留量的测定液相色谱-串联质谱法
GB/T 20767—2006
本标雅规定了牛尿中下米赤霉醇、己烯雌酚、己烷雌懿、双烯雌酚残留量液相色谱串联质谱测定法。
本标准适用于牛尿中玉米亦霉醇，己烯雌酚、亡烧雌酚、双烯雌酚残留量的测定，本标准的方法检出限：玉米亦霉醇和已烷雌酚为0.5多/L.已烯雌酚和双烯雌酚为1.0/L2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修败单（不包括期误的内容）或修订版均不适用工本标难，然而，鼓刷根据不标达成协设的各方研是否可使用这些文件的最新版本。凡尼不注H期的引用文件，其最新版本适用于本标。(GB/T 6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第 1 部分：总则与定义(GB/T 6379. 1—2004.IS0 5725 1:1994.ILT)GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法薰复性与再现性的基本方法(GB/T 6379.2—2004IS()5725-2:1994,IDT)GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682--1992,neISO3696：1987）3原理
免疫亲和杜内含有的特异性抗体选择性地与试样中己烯雌酚、己烷雌、双烯雌酚和玉米赤霉醇结台，形成抗体-抗原复合体，用水淋洗柱除去杂质，用洗脱剂洗脱吸附在柱上的日标物，收集洗脱液，试液用液相色谱·串联质谱仪测定.保留时间和离子半度比定性，内标法定量。4试剂和材料
除另有说明外,所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水，4.1中醇：色谱纯。
4.2乙醇：色谱纯。
4.3乙腈色谱纯。
4.4淋洗液：将Ranlax试剂盒中提供的淋洗原液用去离子水按：20稀释、4.5洗脱瑕：乙醇！水（70130)、量最7G ml乙醇1.2)与 30 mL去离了水混命4.6储备液;将Randox试剂盒盆中提供的偌备原液用去离于水按15稀释。4.7免疫亲和层析柱:Raidax或相当者，4..1宝来赤霉醇免疫亲和层析杜：和柱的最太容量为10n下米亦霉醇。4.7.2二苯乙烯免疫亲和层析柱：亲和柱的敢人容吊为50g已烯雕酚，50ng已烷雌酚、50ng1）给出这一信息足为了方便本标泄的使用者、并不表示对该产品的以可。如果其他产品能有相后的效鼎、则可使用这些等效的产品
GB/1 20767—2006
双烯雌酚，
4.8激素准物质：玉米赤霉醇（包折α玉米亦莓醇和3-上米赤醇，50%）纯度97已烯酚，纯度299米：起烷雌酚，纯度热98火：双烯雌酚，纯度98%，4.9激素标准溶液：分别准确称取适量的玉米赤霉醇、已烯雌酚、已烷雌酚利双烯雄酚标准物质，用甲醇(4.1)配制成1,0 mg/ml.标准储备溶液：再根据需要以甲醇配制成不同浓度的混合标准溶液作为标准T作溶液，媒存于1冰箱中，可使用三个月4、10内标标准物质：上米赤据醇-1氛代（包括α玉米亦霉醇-4氛代和3-下米赤密醇1尔代.条50%）纯度99%;已烯雌酚-8气代,纯度热98头4.11内标标准溶液：准确称取适员玉米动得醇4氛代和已烯摊酚-8氛代标推物质，用甲醇分别配制成1.0Ig/mL标准储备溶液，再以中醇稀释成适用浓度的混合内标标准工作溶液，保存于4℃冰箱中,可使用三个片,
4.12滤膜：孔径0.45mm，wwW.bzxz.Net
5仪器
5.1液相色谱-中联质谱联用仪：配有大气压化学电离源。5.2离感机:转速人于3 000 r/min5.3氮气浓缩仪。
5. 4 涡旋荡器。
6试样的制备与保存
6.1 试样的制备
取有代表性样品，制成实验宰样品。试样分为两份，置于样品瓶巾，密封，并做上标记。6.2 试样保存
将试样置于2℃～8℃下保存：
7测定步骤
7.1基质混合标准溶液的制备
7.1.1样品称取
5个阴性牛尿样品.每个1 :T.于!:0 ml.离心管中，3 000 1/min离心（5.2）15 min，间5_支10mI试管中.分别加人不同量泥合标准工作液（. 9)，使玉米亦霉孽和己烷雌酚的浓度为1.251g/inL、2.5rig/tml.、!.0ng/ml、12.5ng/ml.、25ng/nL：已烯球和双烯雌酚的浓度为2.5ng/mL、5.0ng/ml.10ng/ml、25ng/ml-、50ug/ml.，再分划l人适量混个内标标准溶液（4.11)，使其浓度均为10ng/mL。加人3mL离心后牛尿的上清液.涡旋（5.1)30溶解，待净化。7.1.2净化
用15ml.淋洗液(1.1)分两次预洗免疫亲和层析柱（4.7),流速不大十3ml./min，[:样，白然流速，用5ml.淋洗液以不人于2ml/nin的速汝淋洗，等体积单复淋洗一次再用5ImnL么离子水以不人于2mL/min的速度淋滤，用4rnL洗脱液（4.5）洗悦，流速不大丁2ml./min，收集洗脱液。将洗脱液在氮气浓缩仪（5.3).上于10℃水浴中次干，加入1n:L流动机，涡旋305溶解。溶液经滤膜（4.12）过滤后：供液相色谱-串联质谱测定，7.2试样溶液的制备
经3000 T/rmin离心15min后待测样品3 ml.十50 ml.离心臀中.加人内标标准上作溶液，使具含量均为2.0g/kg。按7.1.1和7.1.2操作，2
7.3空白基质溶液的制备
GB/T 207672006
取经 3 000 r/min 离心 15 min 斤阴性样品 3 mL于50 mL离心管中,按 7. 1. 1 租 7. 1. 2操作。7.4测定
7.4.1液相色谱条件
色谱柱:7()RBAX Eelipse SB-Cg,3.5 μm,150 mm × 4.6 mm 或相当者;a）
b)柱温:25℃;
流动相：乙晴一水（70+30）：
流速:1. 0 mL/min;
迹样量：50uL，
7.4.2质谱条件
离子化力式：大气压化学电离；扫描方式：负肉子扫描；
检测方式：多反应监测(MRM);
离子源温度：325℃：
雾化压力：0.1035MPa；
气帘气法力:0.069 0 MPat
辅助气压力：0.2415MPa；
喷雾器电流：FuA
电喷雾电压：—4 500V;
定性离子对、定最离子对、碰撞气能量和么簇电压见表1。表１！
四种激素和两种内标物的定性离子对、定量离子对碰撞气能量和去筷电压药物名称
玉米赤雍醇
玉米赤霉醇氯代
己烯陈將
双烯雌酚
己烷雌醛
己烯雌酸8氛
定性离子对(m/2)
32:. 1/277.2
32-.F/303.2
325. 1/208. 9
325.1/263.1
267.0/222.1
267.0/237.1
265,0/221, 1
265.0/235.
263.0/119.
26.0/134.6
275. 1/227. 4
275.1/245.0
7、4.3液相色谱-串联质谱测定
7. 4. 3. 1定性测定
定显离广对(m/)
321.1/277, 2
325.1/263,1
267.C/222.1
265.0/235.1
269.0/134.0
275.1/245.0
碰撞气能量/V
— 35
大簇电法/V
每种被测组分选择1个母离子，2个以上子离子，在相回试验条件下，样品中待测物质和内标物的保留时间之比，,就是相对保留时间，与混合基质标准校准辫液中对应的和对保留时问偏差在士2.5%之内：样品谱图中各纽分定性高子的相对度与浓度接近的混合基质标准校准溶液谱图中对应的定性离了的相对丰度进行比较,若偏差不超过表2规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。3
GB/T20767—2006
相对离广≠度
允许的最人偏差
7.4.3.2定量测定
表2定性确证时相对离子丰度的最大充许偏差5G
-20-- 50
1C ~-2℃
在仪器最工作条件下，苯质混个标准溶液（7.1)分别进样，以工作溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准1.作曲线，采用内标汰进行定量测定。样品溶波中玉米亦等醇、已烯雌酚、已烷雌酚和双烯璀酚激素的响应值应在工作出线范围内，在上述色谱条件和质谱条件下.标准物质液相也谱-串联质谱的多反应监测(MRM)色谱图，参见图 A,1。本方法的淤姚问收率数据套见录B，7.5平行试验
按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。7. 6 空白试验
踪不称取试样外，均按上述步骤同时完成空自试验。8结果计算
试样中被测物的测定结果可由数据处理系统按内标法自动计算.也可按式(1)计算：4×xAx
武中：
X-—试样中被测物残留量，单位为微克每升（ug/l)C
基质标准工作溶液中被测物的浓度，单位为纳克每毫升（1/ml.）：试样溶液中被测物的色谱峰面积；基质柄;准1.作辫滋中被测物的色谱峰面积：试样溶液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL);基质标准工作溶液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mlL)；基质标准工作溶液中内标物的色谱峰面积；试样落液中内标物的色谱峰面积；样液最终定容体积,单位,为旁升(ml.);量取试样溶液的体积，单位为毫升（t）注：玉米亦零醇利已烯雌翻的峰面积或峰高值分别是其两算拘体峰面积或峰高旗的和9精密度
本标谁的精密度数据是按照GB/16379.1和（13/T6379,2的规定确定的·重复性和再现性的值以95的可信度来计算
9. 1重复性
在重复性试验条件下，获得的网次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限产，牛尿中四种激素的含昆范周及虫复性打程见表3-
如果差值超过单复性限，成舍弃试验绍并重新完成两次单个试验的测定。9.2再现性
在再现烂试验条什下，状得的两次独立测试结的绝对差侦不超过再现性限R，牛尿中四种激素的含量范带及再现性存程见表3。
化台秘名称
玉米赤萨醇
己烯雌酚
双烯雌酚
已烷雌醛
表3含量范围及重复性和再现性方程含量范国/[）
0. 5 -~ 1r:
0. 25 ~~5
注，m为荫次测定结果的算术平均值。复性限
Ig r- 0. 565 6 1g m-1. 029 7lg r-- 0. 719 2 lg mx - 0. 268 5Ig r- 3. 531 2 Is m-. 312 7
Ig r=3. 772 8 lg m-0, 418 5
GR/T20767—2006
性限R
Ig R-0. 062 5 1g m-0. 712 8
Jg R-0. 788 3 ig m0. 292 6
ig R=0. 750 7 Ig m-0. 248 7
ig R-o. 869 8 lg m—0, 283 05
GB/T 20767—2006
附录A
（资料性附录）
玉米赤霉醇、己烯雌酚、已烷雌酚、双烯雌酚标准物质及玉米赤骞醇-4氛代、己烯雌酚-8代内标物的多反应监测MIRM)色谱图玉米赤得醇，已烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚标准物质及1米亦霉醇4尔代、已烯雌酚-8氛代内标物的多反应测(MRM)色谱图.见图A.1。2. 54
玉米赤赛醇
）天米赤莓醇
sda-kistagr.t
staisLaju
321.17 277.2
玉米亦需酬-1氛线32.5.1/236.1/min
b）主米亦得醇-+充化
烯雌酚
己烷雌嵌
）双烯屹酚
己烯雌207.0/282. 1
+/nuin
已烷酰酚 269, 0 / 134. 0
双烯雌酚255. 0 / 235. 1
已烯雌-8氛化257.1/245.0
［巴烯雌酚-8代
图A1玉米赤霉醇、己烯雌酚、已烷雌酚、双烯雌酚标准物质及玉米赤需醇-4氛代、已烯雌酚-8氛代内标物的多反应监测（MRM)色谱图附录B
(资料性附录）
回收率
本方法中四种滋素添加浓度及其平均回收率的试验数据，见表B.1GB/T20767—2006
表B.1本方法中四种激素添加浓度及其平均回收率的试验数据激素名称
玉来获醇
已烯嵌酚
双烯雕酚
已烷雌酚
添加浓度/(g/>
均同收率
GB/T20767-2006
中华人民共和国
国家标准
牛尿中玉米赤霉醇、己烯雌酚、已烷雌酚、双烯雌酚残留量的测定液相色谱-串联质谱法
G3/T 20767—2C06
中国标准出版社出版发行
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邮政编码：100545
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电话：68523946685-7528
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元本889×12301/16印张C7字数14千字207年3月第版2007年3月第一次印刷*
书号：135066.125975定价14.00元吉由本社发行中心调换
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