SC/T 7203.1-2007 对虾肝胰腺细小病毒诊断规程 第1部分:PCR检测方法 SC/T7203.1-2007 标准下载解压密码：www.bzxz.net

ICS65.020.30
中华人民共和国水产行业标准
SC/T 7203.12007
对虾肝胰腺细小病毒病诊断规程第1部分：PCR检测法
Diagnostic Protocols for Hepatopancreatic Parvovirus Diseaseof Penaeid Shrimp
Part 1: PCR Methoc
2007-06-14发布
2007-09-01实施
中华人民共和国农业部发布
SC/T7203《对虾肝胰腺细小病毒病诊断规程》分为三个部分第1部分:PCR检测法；
第2部分：组织病理学诊断法；
-第3部分：新鲜织的T-E染色法
本部分为SC/T7203的第1部分。
本部分的附录A为资料性附录。
本部分中中华人民共和国农业部渔业局提出。本部分由全国水产标准化技术委贯会归口。SC/T7203.1-2007
本部分起草单位：中国水产科学研究院黄海水产研究所、全国水产技术推广总站。本部分丰要起草人：黄健、杨冰、陈爱平来晓岭、史成银、杨丛海、魏琦。对虾肝胰腺细小病毒病诊断规程第1部分：PCR检测法
SC/T 7203.1—2007
1警告使用本标准的人员应有正规实验蜜工作的实践经验，本标准并未指出所有可能的安全问题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。2范围
SC/T 7203的本部分规定了对虾肝映腺细小病毒病PCR检测法的原理、试剂与材料、仪器设备、操作步骤和结果判定。
本部分适用丁对虾活体、冰鲜虾产品及其粪便利敏感宿主等样品中肝胰腺细小病毒(hepatopancre-alic Parvovirus,HPV)带寿情况的定性检测。不适于对病毒量或感染活性的估测以及宿主感染程度的评估：
3规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用义件，其随后所有的修改单（不包拆勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准。SC/T 7202.2—2007斑节对虾杆状病毒病诊断规程第:2部分:PCR检测法SC/T 7203.2-2007对虾肝胰腺细小病毒病诊断规程第2部分：组织病理学诊断法4原理
4.1对虾肝胰腺细小病毒病的病原和病理学特征见SC/T7203.2—2007（对虾肝胰腺细小病毒病诊断规程第2部分：组织病理学诊断法）川13.1的规定。
4.2技术原理
按照 SC/T 7202.2--2007 (瑶节对虾杆状病毒病诊断规程 第2 部分:PCR检测法)中 4.2 的规定。5试剂和材料
5.1所需试剂除引物、阳性对照和阴性对照以外按照SC/T 7202.2-2007(斑节对虾杆状病毒病诊断规程第2部分:PCR检测法)中第5章的规定。5.2 10 μHol/L 引物 F1:5'-GGT-GAT-GTG-GAG-GAG-AGA-3', -20'C保存。5.310 uml/L 引物 R1:5'-GTA~ACT-ATC-GCC-GCC-AAC-3',-20C保存。5.4阳性对照为已知HPV阳性的组织或粪便样品的DNA模板：一20℃保存。5.5阴性对照为已知HPV阴性的组织或粪便样品的DVA模板，20C保存。6仪器和设备
所需仪器设备按照SC/T7202.2—2007（斑节对虾杆状病藓病诊断规程第2部分：PCR检测法）中第6章的规定，
SC/T 7203. 1-- --2007
7操作步骤
7.1反应体系的准备www.bzxz.net
7.1.1PCR反应可选择25uL、50uL或100.反应体系进行。7.1.2在PCR前区接表1的要求，加入除Tag酶以外的各项试剂，配制成无酶反应须混物。按10价/支或100份/支分装，保存于.20℃。在临用前，根据所需的反应份数，取出无嗨反应预混物，加入相应休积的Ta嗨，混匀，即成完全的反应预混物。按份/支分装到0.2InLPCR管叫。如果PCR仪不其备热盖功能，再向各管内加人50低液体行蜡。暂存于4℃。表1100份PCR反应预混物所需试剂组成试剂
10×PCR缓净液（无Mr+)
MgC2(25 mmol/ L)
dNTIF(10 nol/L)
10 giol/L引物 FI
10 μimal/L 物 R1
火茵双蒸水
TH DNA案含酶(5 U/mL)
100份反应总体积
25 体系
400 pL
250 μL
25 μL
50u体系
100 gL
500 μl
4 80n aT.
100.体系
1000 gut
200 gel
1000 μL
1000 pl
9600ul
让剂终浓度
200 μmal/L
I gurnel/I.
I μmel/I.
0.05 U/μL
注：25L体系模板量1./反应管；50u体系模板本2μL/反应；100体系模板量4g/反应管7.2样品准备
按照SC/T7202.2—2007（斑节对虾杆状病毒病诊断规程第2部分：PCR检测法）中7.1.2的规定执行，
7.3DNA的提取
按照SC/T7202.2—2007（斑节刘虾杆状病毒病诊断规程第2部分：PCR检测法)十7.1.3的规定执行。
7.4 PCR 扩增
7.4.1在PCR前这，按照表1对各反应体系所需的模板休积要求，间问各支含有1份反应预混物的PCR管帽，分别加人相成体积剂样品DNA提取液。并设阳性对照、阴性对照和空白对照。7.4.2将上述加有样品模板的1CR管带人PCR后区，置于已预热到94C的PCR仪中保温5min，逐只依次快速取出并在于掌型离心机上知暂离心1s-2s，使管盖上的样品模板混人反应预混物中，再立即放回预热的PCR仪中，继续在94C保温5min，再按以下程序进行扩增：94℃1min、60C1mii、72℃1min，40个循环：72℃延仲7nin，最后4℃保温。准备进行产物的电泳。7.5PCR产物电泳
按SC/T7202.2—2007(斑节对虾样状病毒病诊断规程第2部分;PCR检测法)中7.1.57.1,8的规定执行。
8结果判定
8.1附性对照在G28碱基对(bp）处会有一条特定条带出现；阳性样品在628bp处会有特定条带出现：阴性对照和阴性样品在628bp处应无条带出现，空白对照不出现任何条带。阳性对照在628bp处无特2
SC/T 7203.1—2007
定条带出现或阴性对照在628bp处有条带出现都表明PCR失败，应在排除故障和清除污染后，重新取样检测。对虾肝胰腺细小病毒病PCR检测产物序列参见附录A。8.2条带的亮暗表示扩增产物浓度的多少，但并不对应丁模板的量的多少。8.3阳性结果丧明被检样品中存在HPVDNA。对活虾和敏感宿主面言，提示已受IIPV感染：刘冰鲜或冰冻对虾而言,提示曾受到HPV感染。8.4电泳结果的分析和问题排方法见表2。表 2 电泳结果分析
实验缩果
对虾样品
阳性对照和阳性样品在 628 bp处有条带，阴性对照和空白对照无28p条带
阳性对照有条带，但分子显标准没有影像分子量标摊有影像，但阳性对照无条带明件对照或空白对照在628·bp处有祭带出现
阳性对照和性对照绰正常，但已知带毒样品无条带
分子母标准常，旧阳性对照、阴忙对照和样品出现较多杂危或明鼻的弥散区结果判读及原因分析
1. PCR反应正常,结果有效
1.分子量标准失效或加样量太
1.PCR反应失败
2.阳性对照失效
1.微移波器污染
2.试剂污染
3.环境污染
4.操作污染
1.DVA是取失败或降解
2.DNA浓度过高
3.CR抑制物介人
问题排除
史换分子量标准或增加其加样早检查并更换 FCR 反应所用试剂以及PCR程序是否正确
更换阳性对照，意新实验
湾泌微虽移液器,只能用 FCR 后区的微堂移液器取反应产物
更换试剂
清洁实验室及所用仪器设备见SC/T7202.2—2007 (斑节对杆状病毒病诊断规程第2部分：PCR检测法)附录B繁止从 ICR后区殖 FCR 前区的交流加强操作隔离
检查提取 DNA 所用试剂情况,重新实！验，碰认伴品新鲜程度
格样品稀释 10倍以上
稀释样品10倍以上，或中新提收LNA做好热启动操作。样品先要加到HCR1. 未注意热启动操作,使 R
管益，反应预混物频热后，短暂离心(1出现非特异性扩增
～25)以混人样品,还逆放回镇热 PCR仪中
2.酶活性dVTP浓度或Mz2
浓度差异
3.温度控制异带
1.紫外观察仪故障
2.背鼠发红太壳
凝胶:无性何影像，包括 DNA分子量标雄3.凝胶太厚
4.极颤倒或电泳时间过长
5.溴化乙锭(FER)分解失效
确认预混物制备的癌确性、试剂质点，对不同批次的酶垂新测定最仕Mg2+离子浓度
检查 FCR 仪是否复性温度过低
检查紫外观察仪
减少E用乐，将琼脂精凝胶置于清水中 30) rnin后再观察结果
重新制作琼脂糖凝胶片
改正电方向，重新加样电远
重新配制浪化艺锭(EB)
&滨化乙链（EB)有素，试剂的操作和废介物的处矮5L:/T7202.2—2007（斑节对虾杆状病毒病诊断规程，第2部分PCR检测法)附录B的规定执行，3
SC/T7203.1—2007
TGEGAGTCGA
CACAAGATC
GACATATCAC
GAGTTAGGAA
AAGAAGAACC
301 ATATGAAGAG
361 TCTTTCAGAA
CATAAGATAA
TCTAGTATGG
541: TCCAGTTCAT
GO1 TITSAGACAC
661CAATCCGAAG
附录A
资料性附录
对虾肝胰腺细小病毒病 PCR检测产物序列GCCCCTGATG
ATATGFTCAC
ATTATGATGA
AGGAACCAGT
ACAACTAAGG
ACCAGACAAG
GAGCTAAAAC
GATTGAGAGT
CAGCAGTGKT
AGTC.GATGTE
ACTCEATTAC
ACGGAGGGAG
TGGAGGAGAG
GAAGCCTGTA
GAGAAGAGCT
AAATGCACAT
CAGTITGTAT
AAGITTAAAA
TATGTACCCA
TIGAATATCC
ATCTGCACTT
GIGEAACTGC
TTTGTTCGCG
CTAAGGAAAT
AATGTAACAA
TTTTTGACTA
ATACACAATA
ATAAACTTTC
TCGGCAGCAT
ITGGATTTTT
GCHTTCAAGJ
ACGTCACACA
GCTGGAGTAA
GHTIGIGGT
GCGATACTTA
TAACGACAGA
TGCCTATGAA
ATCACCATGA
GAATFICAT
GTAATAGGAT
GGAGTATGTT
GAACAACCTT
TITCCCCCCA
CAAAGGTAGT
TAGCTGTAGT
GCGAGAAACT
CTGHGAGA
ACGACATG
GTATAAACAA
CAITGGIA
CTATAAAGTA
GATTCCAATC
CATACAAACT
TATGACGCGE
TAAATAAAGT
ATACCATGAG
AGTCGAAGTG
GTACAGGIGG
ACCAIGAGAG
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