SC/T 7204.3-2007
基本信息
标准号： SC/T 7204.3-2007
中文名称：对虾桃拉综合征诊断规程 第3部分:RT-PCR检测法
标准类别：水产行业标准(SC)
标准状态：现行
发布日期：2007-06-14
实施日期：2007-09-01
出版语种：简体中文
下载格式：.rar.pdf
下载大小：521851
标准分类号
标准ICS号：农业>>农业和林业>>65.020.30动物饲养和繁殖
中标分类号：农业、林业>>畜牧>>B41动物检疫、兽医与疫病防治
关联标准
出版信息
页数：13
标准价格：12.0 元
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标准简介
SC/T 7204.3-2007 对虾桃拉综合征诊断规程 第3部分:RT-PCR检测法 SC/T7204.3-2007 标准下载解压密码：www.bzxz.net
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标准内容
ICS65.020.30
中华人民共和国水产行业标准
SC/T 7204.3--2007
对虾桃拉综合征诊断规程
第3部分：RT-PCR检测法
Diagnostic Protocols for Taura Syndrome of Penaeid Shrimp-Part 3.RT-PCRMethod
2007-06-14发布
2007-09-01 实施
中华人民共和国农业部发布
SC/I7204《对虾桃拉综合征诊断规程》分为四个-部分：第1部分：外观症状诊断法；
一第2部分：组织病理学诊断法：第3部分：RT-PCR检测法；
-第4部分：指示生物检测法。
本部分为SC/T7204的第3部分
本部分的附录A和附录B为规范性附录,附录C为资料性附录。本部分由中华人民共和国农业部渔业员提出。本部分由全国水产标准化技术委员会归口。SC/T 7204.3---2007
本部分起草单位：中国水产科学研究院黄海水产研究所、全国水产技术摊广总站。本部分主要起草人：黄健、杨冰、陈爱平、宋晓玲、史成银、杨丛海、魏琦。I
对虾桃拉综合征诊断规程
第3部分：RT-PCR检测法
SC/T7204:3—2007
1普告一使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验，本标准并未指出所有可能的安全问题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。2范围
SC/T7204的本部分规定了对虾桃拉综合征RT-PCR检测法的原理，试剂与材料、仪器设备、操作步骤和结果判定。
本部分适用于对虾的各生活期、非对虾的生物和底泥等样品中TSV带毒情况的定性检测、病原筛查和疾病的确诊。不适于对病毒、存在状态（站污、携带和感染状态)或感染活性等的估测以皮宿土感染程度的评估。
3规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容)或修让版均不适用于本标准，然面，鼓励根据本标达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本，凡是不江口期的引用文件，其最新版本适用于本标准。SC/T7202.1一2007斑节对虾杆状病毒病诊断规程第1部分：压片微镜检查汰SC/T7202.2—2007斑节对虾杆状病毒病诊断规程第2部分：PCR检测法SC/T7204.22007‘对虾桃拉综合征诊断规程”第2部分：组织病理学诊断法4原理
4.1桃拉综合征的病原和病理学特征见SC/T7204.2-2007（对虾桃拉综合征诊断规程第2部分：组织病理学诊断法)3.1中的规定：4:2技术原理
逆转录聚合海链式反应（Reverse-transcriprionpolymerasechainreaction，RT-PCR）是先利用依赖于RNA 的 DNA 聚合酶,将待测 RNA逆转录为 DNA;以逆转录后的一段 DNA作为模板,以模板 DNA两端序列互补的一对特异性寡核苷酸序列作为引物，在四种脱氧核糖核苷三磷酸存在下，利用依赖}DVA的DNA聚合酶的催化作用。经过数十次变性、退火和延伸的反应循环,使模板上介于两个引物之问的DNA片段得到特异性地级数扩增，再通过电泳等手段检测到被特异性扩增的片段，从而可揭示微量病妻 RNA的存在：
5试剂和材料
5.1除非另有说明,在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去高子水或相当纯度的水。5.2焦乙酸_乙醋(DEPC)：生化试剂。5.3TRIzaITM试剂:生化试剂。
注：可采用相同功效的产品代替。5.4氯仿。
SC/T7204.3--2007
5.5异丙醇，新开瓶后立即按附录B的要求用无RNA酶的1.5ml.微量离心管分装，1mI./支。5.61khDNA分子量标准：生化试剂。5.7液体石蜡。
5.8溴化乙锭（EB)：生化试剂。5.9琼脂糖：电泳级。
5.10dNTP(10mnvl/L)：生化试剂，含dATIdTTPd(TP、dCTP各1)mrl/L的混合物，-20C保存。
5.11RNA酶的凹抑制剂(RNasin,32U/uL)：生化试剂，-20C保存。5.125×E7.缓冲液：生化试剂，含25rmnol/LN-二羟乙基日氨酸，57.5mmol/L.醋酸钾，40%甘洲，PH8.2，-20℃保存。
5.13rTth DNA聚合酶（5U/uL）：4化试剂，—20t保存。5.14醋酸锰（25mmol/L）：生化试剂，无RNA酶。5.15MMLV通转录（200U/）：生化试剂，-20C保存。5.165×MMLV逆转录酶缓冲液：生化试剂，-20℃保存。5.1710×PCR缓冲液：生化试剂，-20℃保存。5.18MgClz（25mmol/L)：生化试剂，一20保存。5.19TaqDNA聚合游（5U/uL)：生化诚剂，-20C保存，5.20无RNA酶的水按附录A的规定执行.5.21无RVA酶的70%乙醇按附录A的规定执行。5.221×电泳缓冲液按SC/T7202.2--2007（斑节对虾杆状病毒病诊断规程第2部分：PCR检测汰)附录A的规定执行。
5.236×载样缓冲液按SC/T7202.2—2007(斑节对虾杆状病毒病诊断规程第2部分：PCR检测法>附录A的规定执行。
5.2410mg/ml.溴化艺锭(EB)贮存液按SC/T7202.2—2007(斑节对虾杆状病毒病诊断规程第2部分：PCR检测法)附录A的规定执行5.2510μmo)/引物F1;5'-AAG-TAG-ACA-GCX-GCGCTT-3',用无RNA酶的水配制，-20C保存。5.2610 μmol/L 引物 R1:5'-TCA-ATG-AGA-GCT-TGG-IUC-3',用无 RNA酶的水配制，-20C保存。
阳性对照为已知受TSV感染且RT-PCR结果显示明显阳性的样品RNA模板，一70C保存。阳性对照为已知未受TSV感染且RT-PCR结果显示阴性的对虾组织RVA模板，-70C保存。5.28
5.29空白对照为无RNA酶的水模板。6设备与用品
6.1CR仪。
6.2电冰仪：输出直流电压0V~600V。6.3水平电泳槽。
6.4紫外观察仪或避胶成像仪。
6.5台式高速离心机：最高转速可达12000r/min以上。6.6水浴钢
6.7普通冰箱：具冷藏箱，一18心以下冷冻箱体。2
6.8超低温冷藏设备：-80℃
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.6.9电炉或微波炉等其他加热设备：可满足10mL~50ml.液体在250ml:三角烧瓶中加热21min，6.10微量移液器：量程0.5L~10,、5μL~40l,40L~200ml,200mL~1000L6.11无RNA酶的微量移液枪头：市售或按附录B的规定执行：6.12无RVA嗨的1.5 mL微最离心管：市售或按附录B的规定执行，6.13无RVA酶的0.2t1LICR管：市售或按附录B的舰定执行。7操作步骤
7.1反应体系的准备
7.1.1 根据条件可选用单管法RT-PCR或两步法 RT-PCR进行操作。RT-PCR的反应体系可选择 25μL,50 μL 或 100 μLc
7.1.2 单管法RT-PCR反应体系
7.1.2.1 在 PCR前区按表 1 的要求,划入除 r1th LDXA 聚合酶以外的各项试剂,配制成单管法 RT-PCR的无酶反应预辊物：按10份/支或100份/支分装，保存于一20℃。在临用前，概据所需的反应份数,取出无酶反应预混物，加人相应体积的-Tth DNA聚合酶，混匀，即成究全的反应预混物。按1份/支分装到无RVA酶的0.2 mL PCR普中。如果 PCR 仪不具备热益功能,再问各管内人 50 μL液体右蜡。暂存」4℃。
7.1.3两步法RT-PCR反应体系：
7.1.3.1PCR反应体系：在FCR前区按照表2的要求，加人除TagDNA聚合酶以外的各顶试剂，配制成单管法RT-PCR中PCR的无酶反应预混物。按10份/支或100份/支分装，保存于-20C。在临用前，根据所需的反应份数，取出无酶反应赖混物，加人相应体积的TDVA聚合酶，混勾，即成完全的反应预混物，按1份/支分装到0.2mL.PCR管中。如果PCR仪不具备热盖功能，再向各管内加入50L液体石蜡。暂存于4℃。
7.1.3.2逆转录样品预混物：在PCR前区配制100份逆转录样品预混物，向无RXA酶的1.5mL微量离心管内加入700L无RVA酶的水、300L5×MMLV逆转录酶缓冲液、200μL10μmol/引物R1，总体积1200ul混句，分装为10份/支（120m/支），保存于一20℃。7.1.3.3逆转录酶顽混物：临用前，在PCR前区根据待测样品利各种对照样品的数量，配制所需的道转录嗨预混物。10份逆转录酶预混物（100L)的配制方法为：22μL.光RVA酶的水20L5×MIMLV逆转录酶缓冲液、6μLRNasin(32U/uL）、50uL10mmol/LdNTP、2μLMMLV逆转录酶（200U/μL）将所需试剂依次加人光RNA酶的1.5mL微量离心管内混匀后，稍离心，暂存于4C待用。7.2样品的准备
7.2.1样品采按SC/T7202.12007（斑节对邮杆状病毒病诊断规程第1部分：压片品微镜检查法)附录的规定执行。
7.2.2对虾样品按不同的大小或感染期取不同组织样品0.1左右。其中，对虾幼体、存虾取完整个体，3cm以下的幼虾取摘除虾限的头跑部，较人的幼虾可取区或数根鳃丝，成虾取1~2根鳃丝或自心脏或腹部血窦抽取血淋巴，怀疑为慢性期感染的较大幼虾或成虾敢对虾的淋巴器官，非对虾的甲壳类动物参照对虾的方法取样。非生物样品取0.1g-0.5多。7.2.3所取样品分别暨于1.5mL无菌微量离心管中，立即进行RNA提取操作或加人.0.5mL～1mLTRIzo1TM试剂,充分研磨后，暂吋保存了一20，7.3RNA模板的提取
7.3.1RNA操作的要求按附录B的规定执行。SC/F7204.3—2007
7.3.2在群品管中加人0.5m--11mI.TRIzolL试剂，用研磨棒研磨，然后置室温5min。7.3.3删人0.2mL氯伤，振摇以剧烈混合15s，室温放置3minz7.3.4丁4℃下10000r/min离心5min，7.3.5仔细吸取上层水相，移至只无RXA的微量离心誉巾。7.3.6加0.5mL异丙两醇，混勺，胃室温10min。7.3.7于4℃下，10000r/min离心10mim，倒去上清液。7.3.8加人1ml北RNA酶的70%乙醇，振摇1min，呼-」4℃下，10000r/min离心3min，小心倒去上清液。
7.3.91颠衛离心管，于案温晾下沉淀。7.3.10加人20uL--100L无RNA酶的水溶解RVA沉淀，即用于RT-PCR或保存于-7U待用。7.4RT-PCR操作
7.4.1单管法RT-PCR
7.4.1.1在IX.R前区.按照表1对各反应体系所需的RNA模板的体积要求,在PCR 断区向各支含有1份单管法RT-PCR反应须混物的PCR管帽上，分别川人相应体积的各样品的RNA提取液。7.4.1.2将上述加有样品RNA模板的IXR管带人PCR后区，于已预热到60C的PCR仪上保温5emin，快速取出并短暂离心，使管盖.F的样品RNA模板混人单管法RI-ICR预混物中，再立即放预热的PCR仪中，继续在60C保温30min进行逆转录反应，然后升温到94℃2min，再按以下程序进行PCR扩增：94℃455.60℃C45s40个循环；60℃71min，最后4℃保温。准备进行产物的电。7.4.2两步法RT-PCR
7.4.2.1对每一份样品，在只无RNA酶的0.2mLPCR管中，加入12μL逆转录样品预混物（7.1.3.2)利3L待测样品RNA模板。混勾后，稍离心。于70℃水浴中放置5rin，然后放丁冰水中15min：同时，设置以阳性对照、阴性对照利无RVA酶的水为模板的对照，7.4.2.2取10μL逆转录酶预混物（见7.1.3.3)加人工一步骤的PCR背小。混勾后，稍离心。置于42℃下1h
7.4.2.3按照表2对各PCR反成体系所需的逝转录产物的体积要求，在PCR前区向各支含有1份CR反应预混物的PCR管帽上，分别加人相应体积的各样品的逆转录产物。7.4.2.4将上述加有逆转录产物的PCR管带入PCR后区，置于已预热到94C的ICR仪.上保温5min，快速取山并短暂离心，使管益上的逆转录产物泥人PCR预混物中，再文即放回预热的PCR仪中，继续在94C保温2min：然后按以下程序进行护增：94℃45s60℃45s，40个循环；60℃71nin，最后4℃保温。准备进行产物的电泳。
7.5琼脂糖凝胶的制作
按SC/T7202.2—2007（斑节对虾杆状病毒病诊晰规程第2部分：PCR检测法)中7.1.5的规定执行。
7.6电泳
按SC/T7202.2—2007（斑节对虾杆状病毒病诊断规程第2部分：PCR检测法）巾17.1.6的规定执行。
7.7分子量计算
按SC/T7202.2一2007（斑节对虾析状病毒病诊断规程第2部分：PCR检测法）中7.1.7的规定执行。
7.8后处理
按S/T7202.2—2007（斑节对虾杆状每病诊断规程第2部分：PCR检测法）中7.1.8的规定4
执行，
8结果判定
SC/T7204.3—2007
8.1阳性对照在231 bp处会骨一条特定条带出现;阴性对照在231 bP处不出现条带,以无菌水为模板设立的空白对照不出现任何条带。阳性对照在231bp处无特定条带出现或阴性对照在231bp处有条带出现都表明RT-PCR失败，成在排除故障和清除污染后，重新取样检测。8.2条带的亮暗表示增产物浓度的多少，但并不对应于模板的量的多少。8.3样品的电泳结果参照阳性对照和阴性对照组进行判读。在231bp有条带出现表示样品检测结果为阳性，在231bz无条带出现表示样品检测结果为阴性。对虾桃拉综合征RT-PCR检測产物序列参见附录 Ce
8.4阳性结果表明被检样品中存在TSVRVA。对活虾和敏感宿主而言，提示已受TSV感染，8.5电泳结果分析和问题排除方法见表3。表 1 100 份单管法RT-PCR 反应预混物所需试剂组成武·
5×FZ.领冲波
醋酸(25mmnal/L)
dVTP(10 mmol/1.)
10 mmol/1. 引物FI
10 unol/L [物 R1
无RNA酶的水
rIuhDNA聚合酶(sU/L)
100 份反应总体积
25体系
500 μL
250 μL
75 μL
115gml
50gL体系
1000uL
150 μL
230 μl
2.690 μL
100体系
2000 μL
10心μL
300 μL
460μL
5380μL
200 μl
9 800 pL
试剂终浓度
1×EZ缓冲液
2.5 mmol/ L
300 nrol/L
0.46 purl/L:
0.45 μmal/ L
注:25L体系RNA模板为0.SL/反应管;50L体系RNA携板为1L/反应管;100L体系RNA楼极为2L/反座管，表2
10 ×FCR 缓冲皴
MgCl,(25 mmol/L)
dNTP(10 ul/L)
10 rmol/L引 FI
10mol/L引R1
灭菌双蒸水
T(5 /)
100份反应总体积
100份两步法RT-PCR的PCR反应预混物所需试剂组成2.5 L.体系
250叫
10UμL
.1550 ja.
SOr.体系
400 ml
100 aL
200 αL
200 ul
3 100 4l
100 l.休系
800 μL
200 μL
400μL
400 pL
6 200 mL
9 200 μL
试剂终浓度
1×PCR缓冲被
2.0 mmmal/L
200 2ncl/1
0.4purl/L
0.4 μmol/L
注：25μ体系逆转录产物为2μL/反应臀;50山体系转录产物为4μL/反应管1C00uL体系逆转录产为8pL/反应管。
SC/T 7204.32007
实验结果
刘虾样品
阳性对眼和阳性格品在
231bp处有条需，性对
照在231 bp处光:条带，以
无菌水为模板的对照无任
何条带出埋
表3RT-ICR产物的电泳结果分析
结果判读及原因分析
1.RT-PCR反放下常,
缩果有效
阳性对照有条微，但分，
1.分了量标准尖效或
于量标准没有影像
分子量标准有影像,但
阳性对照无条带
阴性对照或空白对照
纠在231 b处有条带出班
性对照和别性对照组
正带，但已知带举样品无
分子益标准正常，但阳
性对照、阴性对照相样品bzxZ.net
出现较多杂带或明显的弥
琼脂糖凝胶片上无江何
影像，包括DNA分了量标
加样太少
1.RT-PCR反应头败
2.阳性对照失效
3.逆转录产物成份邦
制 CR
1.微蛋移液器污染
2.试剂污染
3.环境治染
4、操作浮染
1.RNA模板降解或规
取RVA失败
2.逆转承或PCR抑制
物介人
1.未证意热启动换作
使 PCR 山现非特异性护
2.酶活性变化、dN11
然度变化或 Min2-、Mg2+
浓度差录
3.反应温变控制异带
1.紫外观察仪有故降
2，背景发红太亮
3.凝胶反厚
4.电被点倒或电泳时
间过长
5.分解失效
阿题排除
更换分子昆标准惑增加其加样中检查单管法RTFCR或逆转录及PTR反应，并更换所用试剂纠正出诰翟序
更换阳性对照,重新实验
稀逆转录产物或抽提cTWA或改用单件法RT-PCR检润清洗微益移液开，只能用PLRT区的微氧移液器跑也泳更换试剂
清洁实验室改所用仪器设备见SC/T7202.2—2007（班对虾杆状掘毒病诊断现程，第2部分：PCR检测法)附录B获止从PCR后区到PCR尚区的交流期强操作隔离参阅附录B检查RNA按触的试剂和JI品，重新提取RNA重新提取RNA
做好热启动操作样品先要加到R脊盖上，反应顾混物预热后，离心1s-2s概人样品，退遮放间PCR仪中确认预混物制备的准确性、试剂虚量，对不尚批改的率重新测定最佳Mn2+或Mg2-离于浓度
格查PCR仪
稀查紫外观察仪
减少E川量将琼胎糖凝胶置于清水中30mi后再观察钻果重新制作琼脂糖凝胶片
正电极方向，重新加样电泳
亚新配制澳化乙筑(EB)
澳化乙疑(E13)有毒，试剂的操作和废弃物的处理按SC/T7202.2—2007（斑节对虾杆状病毒病诊断规程第2部分：PCR检测法)附录B的规定执行。A.1无RNA酶的水
附录A
（规范性附录
试剂配制方法
1 0 ml,
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盖上瓶寒,用磁力搅拌器于 37℃C刷烈搅拌12 h,按50mL/瓶～200mL/瓶分装于无RNA酶的试剂瓶内,透气高压蒸汽灭菌15min,拎却后密封保存，注意EIC有毒，应班免吸人、吞食和站着皮肤,操作在避风橱中进行。A.2无RNA酶的70%乙醇
无水艺醇(新开瓶)
加人无RNA酶的水
70 IL
在无RVA酶的玻璃量筒中配制，混匀，按1mL/支～1.2mL/支分装于无RNA酶的1.5mL微量商心管中，保存于20待用。
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B.1一般介绍
附录B
【规范性附录】
RNA的实验室操作要求
在RNA操作过程中，必须注意RNA酶的活性。由于RNA很容易被RVA酶降解，而RNA酶又具有很强的稳定性，Ⅱ广泛存在，因此在操作中要严格防止RNA海污染，并设法达抑制其活性。RNA酶的污染包括内源性的和外源性的。内源性的RNA醉污染是指来自了样品红织本身的RVA酶或生化试剂本身的RVA酶。消除方达卡要是在RVA抽提和操作过程中使用IRVA酶变性剂，如用异硫鼠酸胍、酚、愈份等抽提使RNA酶变性灭活；使用RNA酶抑制剂，如RVasin使RNA酶的活性受到抑：
外源性的RNA酶污染是指来白丁水、玻璃制品、塑料器血、电泳槽、操作人员和微生物等。叮逆过焦乙酸二乙酯（DEPC)、氯仿、十热烘烤等消除：本附录主要介绍外源性RNA酶的消除方法：注意：DLPC、酚和呱盐等有获或有腐蚀坐，应避统吸人、容食和活者皮肽，处理TFPC和氮伤的操作均成在通风橱内进行。
B.2溶液配制
直接用于RNA操作的所有水或无机盐溶液都成该加入DEPC至0.1%，搅拌12h，然后经高压汽火菌15min。不能用DEPC处理的试剂（如含有Tris的溶液）或者不能经高压蒸汽灭菌的试剂，要用经LDEPC处理的水配制，然后经无RNA酶的0.22Mn微孔滤膜过滤除菌，B.3玻璃制品
玻璃器血洗净后，在300C烘烤4h可彻底除去器血上沾污的RVA酶。由于烘烤温度高，不能用任何在300℃下可燃烧、变性或化的材料包裹器血。金属制品也而按玻璃制品的亦法处理。B.4聚丙烯塑料制品
聚丙烯塑料制品可在通风橱内用氣仿漂洗，晾干后小经高压兼汽火菌，最后烘干。也可在加有0.1%DEPC水没泡12h,然后经高压蒸汽灭菌，最后烘下。无RNA的一次性塑料制品，如塑料离心管、PCR管和枪头等也可购买直接使用。B.5电泳槽
许多电泳精由有机玻璃或聚苯乙烯材料制成，不能用氯仿处理，也不能经高压蒸汽灭菌。可川去污剂洗漆，水冲洗后用乙醇干燥，再漫泄了3%HO中，室温下放置10mi然启用含0.1%DEPC的水冲洗电泳槽，晾T并做上标记，供RNA专用：RNA经过RT-PCR后，产物已变成DNA电泳时并不能要对其电泳槽进行无RNA酶处理。B.6人工操作
处理INA的全部操作必须带塑料或乳胶的一次性于套，同时要避免因交谈或其他活动造成的飞涞、落尘带人RNA嗨的污染，必要的情况下戴口罩和实验帽，或在超净台中进行操作。8
B.7防微生物污染
SC/T 7204.3--2007
所有接触RVA的试剂和材料都应保持无菌，一且有微生物污染或生长都必须丢弃。9
SC/T 7204.3—2007
CTTTGGCCAA
AGTIGAAATT
TACAAACAGT
AGTCTCTCT
附录C
（资料性附录】
对虾桃拉综合征Rr-PCR检测产物序列AGTAGACACC
GATAATTTTG
GAAGUTTCTA
AAAZITAA
CGCGCTTGCC
ATACAACAAC
GAATCITGAT
CACATAACGT
TGOTGGGACT
GAGTGGACGA
GAATGATATG
GTFTGAAGTE
TAATTAATGC
CTAATTCCAG
CCAATCACTA
CAGGACCAAG
CTGCTAAGCC
GAGUTAGTGT
ATGAGAATGT
CICTCATTGA
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对虾桃拉综合征诊断规程
第3部分：RT-PCR检测法
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2007-09-01 实施
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一第2部分：组织病理学诊断法：第3部分：RT-PCR检测法；
-第4部分：指示生物检测法。
本部分为SC/T7204的第3部分
本部分的附录A和附录B为规范性附录,附录C为资料性附录。本部分由中华人民共和国农业部渔业员提出。本部分由全国水产标准化技术委员会归口。SC/T 7204.3---2007
本部分起草单位：中国水产科学研究院黄海水产研究所、全国水产技术摊广总站。本部分主要起草人：黄健、杨冰、陈爱平、宋晓玲、史成银、杨丛海、魏琦。I
对虾桃拉综合征诊断规程
第3部分：RT-PCR检测法
SC/T7204:3—2007
1普告一使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验，本标准并未指出所有可能的安全问题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。2范围
SC/T7204的本部分规定了对虾桃拉综合征RT-PCR检测法的原理，试剂与材料、仪器设备、操作步骤和结果判定。
本部分适用于对虾的各生活期、非对虾的生物和底泥等样品中TSV带毒情况的定性检测、病原筛查和疾病的确诊。不适于对病毒、存在状态（站污、携带和感染状态)或感染活性等的估测以皮宿土感染程度的评估。
3规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容)或修让版均不适用于本标准，然面，鼓励根据本标达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本，凡是不江口期的引用文件，其最新版本适用于本标准。SC/T7202.1一2007斑节对虾杆状病毒病诊断规程第1部分：压片微镜检查汰SC/T7202.2—2007斑节对虾杆状病毒病诊断规程第2部分：PCR检测法SC/T7204.22007‘对虾桃拉综合征诊断规程”第2部分：组织病理学诊断法4原理
4.1桃拉综合征的病原和病理学特征见SC/T7204.2-2007（对虾桃拉综合征诊断规程第2部分：组织病理学诊断法)3.1中的规定：4:2技术原理
逆转录聚合海链式反应（Reverse-transcriprionpolymerasechainreaction，RT-PCR）是先利用依赖于RNA 的 DNA 聚合酶,将待测 RNA逆转录为 DNA;以逆转录后的一段 DNA作为模板,以模板 DNA两端序列互补的一对特异性寡核苷酸序列作为引物，在四种脱氧核糖核苷三磷酸存在下，利用依赖}DVA的DNA聚合酶的催化作用。经过数十次变性、退火和延伸的反应循环,使模板上介于两个引物之问的DNA片段得到特异性地级数扩增，再通过电泳等手段检测到被特异性扩增的片段，从而可揭示微量病妻 RNA的存在：
5试剂和材料
5.1除非另有说明,在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去高子水或相当纯度的水。5.2焦乙酸_乙醋(DEPC)：生化试剂。5.3TRIzaITM试剂:生化试剂。
注：可采用相同功效的产品代替。5.4氯仿。
SC/T7204.3--2007
5.5异丙醇，新开瓶后立即按附录B的要求用无RNA酶的1.5ml.微量离心管分装，1mI./支。5.61khDNA分子量标准：生化试剂。5.7液体石蜡。
5.8溴化乙锭（EB)：生化试剂。5.9琼脂糖：电泳级。
5.10dNTP(10mnvl/L)：生化试剂，含dATIdTTPd(TP、dCTP各1)mrl/L的混合物，-20C保存。
5.11RNA酶的凹抑制剂(RNasin,32U/uL)：生化试剂，-20C保存。5.125×E7.缓冲液：生化试剂，含25rmnol/LN-二羟乙基日氨酸，57.5mmol/L.醋酸钾，40%甘洲，PH8.2，-20℃保存。
5.13rTth DNA聚合酶（5U/uL）：4化试剂，—20t保存。5.14醋酸锰（25mmol/L）：生化试剂，无RNA酶。5.15MMLV通转录（200U/）：生化试剂，-20C保存。5.165×MMLV逆转录酶缓冲液：生化试剂，-20℃保存。5.1710×PCR缓冲液：生化试剂，-20℃保存。5.18MgClz（25mmol/L)：生化试剂，一20保存。5.19TaqDNA聚合游（5U/uL)：生化诚剂，-20C保存，5.20无RNA酶的水按附录A的规定执行.5.21无RVA酶的70%乙醇按附录A的规定执行。5.221×电泳缓冲液按SC/T7202.2--2007（斑节对虾杆状病毒病诊断规程第2部分：PCR检测汰)附录A的规定执行。
5.236×载样缓冲液按SC/T7202.2—2007(斑节对虾杆状病毒病诊断规程第2部分：PCR检测法>附录A的规定执行。
5.2410mg/ml.溴化艺锭(EB)贮存液按SC/T7202.2—2007(斑节对虾杆状病毒病诊断规程第2部分：PCR检测法)附录A的规定执行5.2510μmo)/引物F1;5'-AAG-TAG-ACA-GCX-GCGCTT-3',用无RNA酶的水配制，-20C保存。5.2610 μmol/L 引物 R1:5'-TCA-ATG-AGA-GCT-TGG-IUC-3',用无 RNA酶的水配制，-20C保存。
阳性对照为已知受TSV感染且RT-PCR结果显示明显阳性的样品RNA模板，一70C保存。阳性对照为已知未受TSV感染且RT-PCR结果显示阴性的对虾组织RVA模板，-70C保存。5.28
5.29空白对照为无RNA酶的水模板。6设备与用品
6.1CR仪。
6.2电冰仪：输出直流电压0V~600V。6.3水平电泳槽。
6.4紫外观察仪或避胶成像仪。
6.5台式高速离心机：最高转速可达12000r/min以上。6.6水浴钢
6.7普通冰箱：具冷藏箱，一18心以下冷冻箱体。2
6.8超低温冷藏设备：-80℃
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.6.9电炉或微波炉等其他加热设备：可满足10mL~50ml.液体在250ml:三角烧瓶中加热21min，6.10微量移液器：量程0.5L~10,、5μL~40l,40L~200ml,200mL~1000L6.11无RNA酶的微量移液枪头：市售或按附录B的规定执行：6.12无RVA嗨的1.5 mL微最离心管：市售或按附录B的规定执行，6.13无RVA酶的0.2t1LICR管：市售或按附录B的舰定执行。7操作步骤
7.1反应体系的准备
7.1.1 根据条件可选用单管法RT-PCR或两步法 RT-PCR进行操作。RT-PCR的反应体系可选择 25μL,50 μL 或 100 μLc
7.1.2 单管法RT-PCR反应体系
7.1.2.1 在 PCR前区按表 1 的要求,划入除 r1th LDXA 聚合酶以外的各项试剂,配制成单管法 RT-PCR的无酶反应预辊物：按10份/支或100份/支分装，保存于一20℃。在临用前，概据所需的反应份数,取出无酶反应预混物，加人相应体积的-Tth DNA聚合酶，混匀，即成究全的反应预混物。按1份/支分装到无RVA酶的0.2 mL PCR普中。如果 PCR 仪不具备热益功能,再问各管内人 50 μL液体右蜡。暂存」4℃。
7.1.3两步法RT-PCR反应体系：
7.1.3.1PCR反应体系：在FCR前区按照表2的要求，加人除TagDNA聚合酶以外的各顶试剂，配制成单管法RT-PCR中PCR的无酶反应预混物。按10份/支或100份/支分装，保存于-20C。在临用前，根据所需的反应份数，取出无酶反应赖混物，加人相应体积的TDVA聚合酶，混勾，即成完全的反应预混物，按1份/支分装到0.2mL.PCR管中。如果PCR仪不具备热盖功能，再向各管内加入50L液体石蜡。暂存于4℃。
7.1.3.2逆转录样品预混物：在PCR前区配制100份逆转录样品预混物，向无RXA酶的1.5mL微量离心管内加入700L无RVA酶的水、300L5×MMLV逆转录酶缓冲液、200μL10μmol/引物R1，总体积1200ul混句，分装为10份/支（120m/支），保存于一20℃。7.1.3.3逆转录酶顽混物：临用前，在PCR前区根据待测样品利各种对照样品的数量，配制所需的道转录嗨预混物。10份逆转录酶预混物（100L)的配制方法为：22μL.光RVA酶的水20L5×MIMLV逆转录酶缓冲液、6μLRNasin(32U/uL）、50uL10mmol/LdNTP、2μLMMLV逆转录酶（200U/μL）将所需试剂依次加人光RNA酶的1.5mL微量离心管内混匀后，稍离心，暂存于4C待用。7.2样品的准备
7.2.1样品采按SC/T7202.12007（斑节对邮杆状病毒病诊断规程第1部分：压片品微镜检查法)附录的规定执行。
7.2.2对虾样品按不同的大小或感染期取不同组织样品0.1左右。其中，对虾幼体、存虾取完整个体，3cm以下的幼虾取摘除虾限的头跑部，较人的幼虾可取区或数根鳃丝，成虾取1~2根鳃丝或自心脏或腹部血窦抽取血淋巴，怀疑为慢性期感染的较大幼虾或成虾敢对虾的淋巴器官，非对虾的甲壳类动物参照对虾的方法取样。非生物样品取0.1g-0.5多。7.2.3所取样品分别暨于1.5mL无菌微量离心管中，立即进行RNA提取操作或加人.0.5mL～1mLTRIzo1TM试剂,充分研磨后，暂吋保存了一20，7.3RNA模板的提取
7.3.1RNA操作的要求按附录B的规定执行。SC/F7204.3—2007
7.3.2在群品管中加人0.5m--11mI.TRIzolL试剂，用研磨棒研磨，然后置室温5min。7.3.3删人0.2mL氯伤，振摇以剧烈混合15s，室温放置3minz7.3.4丁4℃下10000r/min离心5min，7.3.5仔细吸取上层水相，移至只无RXA的微量离心誉巾。7.3.6加0.5mL异丙两醇，混勺，胃室温10min。7.3.7于4℃下，10000r/min离心10mim，倒去上清液。7.3.8加人1ml北RNA酶的70%乙醇，振摇1min，呼-」4℃下，10000r/min离心3min，小心倒去上清液。
7.3.91颠衛离心管，于案温晾下沉淀。7.3.10加人20uL--100L无RNA酶的水溶解RVA沉淀，即用于RT-PCR或保存于-7U待用。7.4RT-PCR操作
7.4.1单管法RT-PCR
7.4.1.1在IX.R前区.按照表1对各反应体系所需的RNA模板的体积要求,在PCR 断区向各支含有1份单管法RT-PCR反应须混物的PCR管帽上，分别川人相应体积的各样品的RNA提取液。7.4.1.2将上述加有样品RNA模板的IXR管带人PCR后区，于已预热到60C的PCR仪上保温5emin，快速取出并短暂离心，使管盖.F的样品RNA模板混人单管法RI-ICR预混物中，再立即放预热的PCR仪中，继续在60C保温30min进行逆转录反应，然后升温到94℃2min，再按以下程序进行PCR扩增：94℃455.60℃C45s40个循环；60℃71min，最后4℃保温。准备进行产物的电。7.4.2两步法RT-PCR
7.4.2.1对每一份样品，在只无RNA酶的0.2mLPCR管中，加入12μL逆转录样品预混物（7.1.3.2)利3L待测样品RNA模板。混勾后，稍离心。于70℃水浴中放置5rin，然后放丁冰水中15min：同时，设置以阳性对照、阴性对照利无RVA酶的水为模板的对照，7.4.2.2取10μL逆转录酶预混物（见7.1.3.3)加人工一步骤的PCR背小。混勾后，稍离心。置于42℃下1h
7.4.2.3按照表2对各PCR反成体系所需的逝转录产物的体积要求，在PCR前区向各支含有1份CR反应预混物的PCR管帽上，分别加人相应体积的各样品的逆转录产物。7.4.2.4将上述加有逆转录产物的PCR管带入PCR后区，置于已预热到94C的ICR仪.上保温5min，快速取山并短暂离心，使管益上的逆转录产物泥人PCR预混物中，再文即放回预热的PCR仪中，继续在94C保温2min：然后按以下程序进行护增：94℃45s60℃45s，40个循环；60℃71nin，最后4℃保温。准备进行产物的电泳。
7.5琼脂糖凝胶的制作
按SC/T7202.2—2007（斑节对虾杆状病毒病诊晰规程第2部分：PCR检测法)中7.1.5的规定执行。
7.6电泳
按SC/T7202.2—2007（斑节对虾杆状病毒病诊断规程第2部分：PCR检测法）巾17.1.6的规定执行。
7.7分子量计算
按SC/T7202.2一2007（斑节对虾析状病毒病诊断规程第2部分：PCR检测法）中7.1.7的规定执行。
7.8后处理
按S/T7202.2—2007（斑节对虾杆状每病诊断规程第2部分：PCR检测法）中7.1.8的规定4
执行，
8结果判定
SC/T7204.3—2007
8.1阳性对照在231 bp处会骨一条特定条带出现;阴性对照在231 bP处不出现条带,以无菌水为模板设立的空白对照不出现任何条带。阳性对照在231bp处无特定条带出现或阴性对照在231bp处有条带出现都表明RT-PCR失败，成在排除故障和清除污染后，重新取样检测。8.2条带的亮暗表示增产物浓度的多少，但并不对应于模板的量的多少。8.3样品的电泳结果参照阳性对照和阴性对照组进行判读。在231bp有条带出现表示样品检测结果为阳性，在231bz无条带出现表示样品检测结果为阴性。对虾桃拉综合征RT-PCR检測产物序列参见附录 Ce
8.4阳性结果表明被检样品中存在TSVRVA。对活虾和敏感宿主而言，提示已受TSV感染，8.5电泳结果分析和问题排除方法见表3。表 1 100 份单管法RT-PCR 反应预混物所需试剂组成武·
5×FZ.领冲波
醋酸(25mmnal/L)
dVTP(10 mmol/1.)
10 mmol/1. 引物FI
10 unol/L [物 R1
无RNA酶的水
rIuhDNA聚合酶(sU/L)
100 份反应总体积
25体系
500 μL
250 μL
75 μL
115gml
50gL体系
1000uL
150 μL
230 μl
2.690 μL
100体系
2000 μL
10心μL
300 μL
460μL
5380μL
200 μl
9 800 pL
试剂终浓度
1×EZ缓冲液
2.5 mmol/ L
300 nrol/L
0.46 purl/L:
0.45 μmal/ L
注:25L体系RNA模板为0.SL/反应管;50L体系RNA携板为1L/反应管;100L体系RNA楼极为2L/反座管，表2
10 ×FCR 缓冲皴
MgCl,(25 mmol/L)
dNTP(10 ul/L)
10 rmol/L引 FI
10mol/L引R1
灭菌双蒸水
T(5 /)
100份反应总体积
100份两步法RT-PCR的PCR反应预混物所需试剂组成2.5 L.体系
250叫
10UμL
.1550 ja.
SOr.体系
400 ml
100 aL
200 αL
200 ul
3 100 4l
100 l.休系
800 μL
200 μL
400μL
400 pL
6 200 mL
9 200 μL
试剂终浓度
1×PCR缓冲被
2.0 mmmal/L
200 2ncl/1
0.4purl/L
0.4 μmol/L
注：25μ体系逆转录产物为2μL/反应臀;50山体系转录产物为4μL/反应管1C00uL体系逆转录产为8pL/反应管。
SC/T 7204.32007
实验结果
刘虾样品
阳性对眼和阳性格品在
231bp处有条需，性对
照在231 bp处光:条带，以
无菌水为模板的对照无任
何条带出埋
表3RT-ICR产物的电泳结果分析
结果判读及原因分析
1.RT-PCR反放下常,
缩果有效
阳性对照有条微，但分，
1.分了量标准尖效或
于量标准没有影像
分子量标准有影像,但
阳性对照无条带
阴性对照或空白对照
纠在231 b处有条带出班
性对照和别性对照组
正带，但已知带举样品无
分子益标准正常，但阳
性对照、阴性对照相样品bzxZ.net
出现较多杂带或明显的弥
琼脂糖凝胶片上无江何
影像，包括DNA分了量标
加样太少
1.RT-PCR反应头败
2.阳性对照失效
3.逆转录产物成份邦
制 CR
1.微蛋移液器污染
2.试剂污染
3.环境治染
4、操作浮染
1.RNA模板降解或规
取RVA失败
2.逆转承或PCR抑制
物介人
1.未证意热启动换作
使 PCR 山现非特异性护
2.酶活性变化、dN11
然度变化或 Min2-、Mg2+
浓度差录
3.反应温变控制异带
1.紫外观察仪有故降
2，背景发红太亮
3.凝胶反厚
4.电被点倒或电泳时
间过长
5.分解失效
阿题排除
更换分子昆标准惑增加其加样中检查单管法RTFCR或逆转录及PTR反应，并更换所用试剂纠正出诰翟序
更换阳性对照,重新实验
稀逆转录产物或抽提cTWA或改用单件法RT-PCR检润清洗微益移液开，只能用PLRT区的微氧移液器跑也泳更换试剂
清洁实验室改所用仪器设备见SC/T7202.2—2007（班对虾杆状掘毒病诊断现程，第2部分：PCR检测法)附录B获止从PCR后区到PCR尚区的交流期强操作隔离参阅附录B检查RNA按触的试剂和JI品，重新提取RNA重新提取RNA
做好热启动操作样品先要加到R脊盖上，反应顾混物预热后，离心1s-2s概人样品，退遮放间PCR仪中确认预混物制备的准确性、试剂虚量，对不尚批改的率重新测定最佳Mn2+或Mg2-离于浓度
格查PCR仪
稀查紫外观察仪
减少E川量将琼胎糖凝胶置于清水中30mi后再观察钻果重新制作琼脂糖凝胶片
正电极方向，重新加样电泳
亚新配制澳化乙筑(EB)
澳化乙疑(E13)有毒，试剂的操作和废弃物的处理按SC/T7202.2—2007（斑节对虾杆状病毒病诊断规程第2部分：PCR检测法)附录B的规定执行。A.1无RNA酶的水
附录A
（规范性附录
试剂配制方法
1 0 ml,
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盖上瓶寒,用磁力搅拌器于 37℃C刷烈搅拌12 h,按50mL/瓶～200mL/瓶分装于无RNA酶的试剂瓶内,透气高压蒸汽灭菌15min,拎却后密封保存，注意EIC有毒，应班免吸人、吞食和站着皮肤,操作在避风橱中进行。A.2无RNA酶的70%乙醇
无水艺醇(新开瓶)
加人无RNA酶的水
70 IL
在无RVA酶的玻璃量筒中配制，混匀，按1mL/支～1.2mL/支分装于无RNA酶的1.5mL微量商心管中，保存于20待用。
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B.1一般介绍
附录B
【规范性附录】
RNA的实验室操作要求
在RNA操作过程中，必须注意RNA酶的活性。由于RNA很容易被RVA酶降解，而RNA酶又具有很强的稳定性，Ⅱ广泛存在，因此在操作中要严格防止RNA海污染，并设法达抑制其活性。RNA酶的污染包括内源性的和外源性的。内源性的RNA醉污染是指来自了样品红织本身的RVA酶或生化试剂本身的RVA酶。消除方达卡要是在RVA抽提和操作过程中使用IRVA酶变性剂，如用异硫鼠酸胍、酚、愈份等抽提使RNA酶变性灭活；使用RNA酶抑制剂，如RVasin使RNA酶的活性受到抑：
外源性的RNA酶污染是指来白丁水、玻璃制品、塑料器血、电泳槽、操作人员和微生物等。叮逆过焦乙酸二乙酯（DEPC)、氯仿、十热烘烤等消除：本附录主要介绍外源性RNA酶的消除方法：注意：DLPC、酚和呱盐等有获或有腐蚀坐，应避统吸人、容食和活者皮肽，处理TFPC和氮伤的操作均成在通风橱内进行。
B.2溶液配制
直接用于RNA操作的所有水或无机盐溶液都成该加入DEPC至0.1%，搅拌12h，然后经高压汽火菌15min。不能用DEPC处理的试剂（如含有Tris的溶液）或者不能经高压蒸汽灭菌的试剂，要用经LDEPC处理的水配制，然后经无RNA酶的0.22Mn微孔滤膜过滤除菌，B.3玻璃制品
玻璃器血洗净后，在300C烘烤4h可彻底除去器血上沾污的RVA酶。由于烘烤温度高，不能用任何在300℃下可燃烧、变性或化的材料包裹器血。金属制品也而按玻璃制品的亦法处理。B.4聚丙烯塑料制品
聚丙烯塑料制品可在通风橱内用氣仿漂洗，晾干后小经高压兼汽火菌，最后烘干。也可在加有0.1%DEPC水没泡12h,然后经高压蒸汽灭菌，最后烘下。无RNA的一次性塑料制品，如塑料离心管、PCR管和枪头等也可购买直接使用。B.5电泳槽
许多电泳精由有机玻璃或聚苯乙烯材料制成，不能用氯仿处理，也不能经高压蒸汽灭菌。可川去污剂洗漆，水冲洗后用乙醇干燥，再漫泄了3%HO中，室温下放置10mi然启用含0.1%DEPC的水冲洗电泳槽，晾T并做上标记，供RNA专用：RNA经过RT-PCR后，产物已变成DNA电泳时并不能要对其电泳槽进行无RNA酶处理。B.6人工操作
处理INA的全部操作必须带塑料或乳胶的一次性于套，同时要避免因交谈或其他活动造成的飞涞、落尘带人RNA嗨的污染，必要的情况下戴口罩和实验帽，或在超净台中进行操作。8
B.7防微生物污染
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所有接触RVA的试剂和材料都应保持无菌，一且有微生物污染或生长都必须丢弃。9
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CTTTGGCCAA
AGTIGAAATT
TACAAACAGT
AGTCTCTCT
附录C
（资料性附录】
对虾桃拉综合征Rr-PCR检测产物序列AGTAGACACC
GATAATTTTG
GAAGUTTCTA
AAAZITAA
CGCGCTTGCC
ATACAACAAC
GAATCITGAT
CACATAACGT
TGOTGGGACT
GAGTGGACGA
GAATGATATG
GTFTGAAGTE
TAATTAATGC
CTAATTCCAG
CCAATCACTA
CAGGACCAAG
CTGCTAAGCC
GAGUTAGTGT
ATGAGAATGT
CICTCATTGA
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