SC/T 7204.4-2007 对虾桃拉综合征诊断规程 第4部分:指示生物检测法 SC/T7204.4-2007 标准下载解压密码：www.bzxz.net

ICS65.020.30
中华人民共和国水产行业标准
SC/T 7204.4--2007
对虾桃拉综合征诊断规程
第4部分：指示生物检测法
Diagnostic Protocols for Taura Syndrome of Penaeid Shrimp-Part 4: Bioassay Method
2007-06-14发布
2007-09~01实施
中华人民共和国农业部发布
5CT7204《对虾桃拉综合征诊断规程分为四个部分：-第1部分：外观症状诊断法；
第2部分：组织病理学诊断法
第3部分：RT-PCR检测法；
一第4部分：指示生物检测法。
本部分为SC/T7204的第4部分
本部分的附录A和附录B为规范性附录。本部分由中华人民共和国农业部渔业局提出。本部分由全国水产称准化技术委员会归口。SC/T 7204.4—2007
本部分起草单位：中国水产科学研究院黄海水产研究所、全国水产技术推总站，本部分主要起草人：黄健、杨冰、陈爱平、米晓玲、史成银、杨丛海、魏琦。1范围
对虾桃拉综合征诊断规程
第4部分：指示生物检测法
SC/T7204.4—2007
SC/T7204的本部分规定了对虾桃拉综合征指示生物检测法的原理试剂与材料、仪器设备、操作步骤和结果判楚。
本部分适用于通过外部症状检查、RT-PCR检测或组织病理诊断查出为桃拉综合征阳性的样品进行病毒感染活性的检测或对怀凝患桃拉综合征的动物或携书TSV的其它材料进行病毒的感染活性检测。
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过标准的引用而成为本标准的条款，凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否而使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用予本标准。SC/T7202.1—2007斑节对虾杠状病毒病诊断规程：第1部分：压片显微镜检查法SC/T7202.3-2007斑节对虾扦状病牵病诊断规程第3部分：组织病理学诊断法SC/T7204.2—2007对虾桃拉综合征诊断规程第2部分：组织病理学诊断法3原理Www.bzxZ.net
3.1桃拉综合征的病原和病理学特征见S/T7204.2—2007(对虾桃拉综合征诊断规程第2部分：组织病理学诊断法）第3.1条的规定。
3.2技术原理
以健康活没或无特定病原的凡纳滨对虾(Litopenaeustaunnamei）幼韩作为病毒感染的指示生物，采用经口投喂或注射接种的方法，观察指示生物的发病和死亡情况，并借助组织病理学诊断法对指示生物进行确诊，从而判定待检样品中1SV的感染能力。4试剂和材料
4.1除非另有说明,在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。4.2含氯消毒剂医用消毒剂。
4.3TV缓冲液按附录A的规定执行。4.4 2%无菌盐水按附录 A 的规定执行。4.5戴维森氏AFA(DavidscmsAFA)固定液按SC/T7202.3-2007（斑节对虾杆状病毒病诊断规程第3部分:组织病理学诊断法)附录A的规定执行。4.6人工海水，盐度20～30
4.7指示虾为健康活泼的凡纳滨对虾(L，nei)的幼虾，体重1g～7g，经病理检查诊断为未患白斑病和桃拉综合征，且不存在其他明显病理症状的键康对虾群体。4.8碎冰。
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5仪器设备
5.1匀浆器转速达10000r/mim以上，推荐采用外套固定，内刀旋转的保护性剪切约浆刀具。5.2高速冷冻离心机,转速可达12000rmin以.上,离心温度为4C。5.3超速冷冻离心机，转速可达3000r/min以上，离心温度为4℃5.4普通冰柜或冰箱，具冷藏箱，并带-18℃以下冷冻箱休。5.5超低温冰箱，80℃。
5.6不锈钢切刀。
5.7塑料或木制势板。
5.8—次性乳胶或類料手套。
5.9不锈钢药匙。
5.101.5ml.火菌塑料离心管。
5.11江射器体积10mL
5.121mL微量注射器。
5.130.45gem除菌滤器，
5.14无菌试管和烧杯等
5.15水族箱，穿积120L以F,用前经含氯消毒剂在2000mg/T.有效氯含量消毒30min，再用白求水冲净。
5.16控温，控温范围10%℃35%，控溢精度=1℃以内。5.17充气泵。
5.18气石，用前经含氯消毒剂在2000mg/L有效氯含量消毒10min以上。5.19充气管，用前经含氯消毒剂在2000mg/l.有效氯含量消毒10min以上，5.20虹吸管，用前经含氯消毒剂在2000mg/L有效氯含量消毒10min以_F.。5.21表而温度计，用前经含氯消毒剂在2000mg/L有效氯含量消毒10min以.上。6操作步骤
6.1材料物品处理
感染性污染的废水、对虾和其他感染性污染的材料利物品的处理按附录B的规定斑行。6.2样品保存
待诊断伴品推荐采用活体取样方法，死后动物、非敏感宿主或非正物样品在室温下保存不超过6h、4℃保存不超过48h，一20℃保存数周以内、一80%保存数月或数年以内。6.3指示虾的暂养
6.3.1每10尾指示虾为1组，暂养在盐度为20~30的消毒海水中，水体100L~500L，保持充气，温度控制在22℃~28℃，骨夜温差2℃，分2次投喂适量配合饲料，每天吸污，并换水1/3~2/36.3.2指示虾在室内暂养3d以上，稳定存活后可用于口服投喂或注射接种法感染。6.4口服法感染
6.4.1口服法感染适用于较小的指示虾。6.4.2将10g~50g特测对虾样品切成1mm--5mm大小的碎块，按5g/包分装于小塑料袋中，保存于-20℃（数周)或一80%（数月至数年）。6.4.3对照组指示虾始终投喂正常配合饲料；检测组指示虾前天每天投限5g~·10g切碎的样品，3d2
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后批喂正常配合饲料。若投喂的病料或配合饲料明显过剩，则减少投喂量：按原暂养条件暂养观察到全部动物死亡或首次投喂感染的第14为止。各组虹吸管及其他用具需分组消毒或隔离便用6.5注射接种法感染
6.5.1射接种法适用于较的指示。6.5.2待测样品的准备
6.5.2.1血淋巴样品可用TN缓冲液稀释到1/10~1/20，用0.45um除菌滤器过滤除菌，不需进一步处理就可用来注射指示虾：
6.5.2.2怀疑感染TSV的虾头或刘虾个体的样品带进行勾浆及抽，如果待测样品处于急性期可使用全虾；如果待测样品处丁傻性期或无症状状态应便用虾头。：取5g~10g虾头或对虾个体样品，去除甲壳,按1:2～1:3的比例在其中加人1N缓冲液或2%无菌盐水。用勾浆器将上述样品对虾勾浆，为防止样品过热，在整个操作过程中要把感纠织和勾浆液的容器置于碎泳中保持冷却。6.5.2.3其他可能携带TSV的样品取30g~100g，按1:2~1:3的比例加入.TN缓冲液或2%无菌盐水浆。
6.5,2.44℃下3000.1/min离心10min以登清匀浆液，弃沉淀，保留上清液。6.5.2.5上清液再于10000r/mi在4℃离心30mlin1-50)rmin。充沉淀,保留上清液。6.5.2.6如果待检样品病辞含量可能较低，或L洁液体积过人(100mL),可将上清激在60000r/min于4℃离心2h,弃上清液，在沉淀中加人5倍体积的2%无菌盐水，用滴管吹打总浮混勺，再于10000r/mi离心10xin.保留上清液。6.5.2.7用2%无菌盐水将上一步骤得到的上清液稀释到1/10和1/100。6.5.2.8用5mL注射器和0.45m除菌滤器过滤上一步骤中稀释的上清液。用无菌试管或烧怀收集过滤液。
6.5.2.9滤分装丁1.5rmL灭菌塑料离心管中,可保存在-20℃（保存数周）、一80℃（长期保存几个月到几年)或立即用来注射指示虾。6.5.3注射接种方法
6.5.3.1用 1mL微量注射器将6.5.1中准备好的样品液注射接种暂养的指示虾,每克虾体重注射0.01 mls
用同样体积的2%无菌盐水作为对照注射1组指示虾，对照组的注射成在注射群品组之前完成。6.5.3.2从指示虾的第三腹节处向前进针，肌肉注射到指示虾的体内。6.5.3.3注射接种后将指示虾按原暂养条件分组暂养监测，至所有指示虾死亡或注射后第七天为止。6.6感染结果诊断
题死对虾和最后声存的检泌组和对照组的全部指示虾样品用裁维森氏AFA(Davidson'sAFA)固定液按SC/T7202,1一2007（斑节对虾杆状病毒病诊断规程第1部分：压片显镜检查法)附录B现定的方法固定,并按SC/T 7204.2一2007(对虾桃拉综合征诊断规程第2部分：组织病理学诊断法)现定的方法进行病理学诊断。
7结果判断
7.1结果判定的首要依据
7.1.1对照组的所有指示虾应该不山现杆何桃拉综合征或其他疾病的病症,组织病理学诊断结果应该正常。否则本次检测结果无效，需要分析对照组发生感染的原因，然后再重新选取指示虾并重新逊行检测试验。
7.1.2检测组发病和死亡的指示虾只有符合SC/T7204.2—2007（对虾桃拉综合征诊断规程第2s
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部分：组织病理学诊断法)的诊断结果才能判定为桃拉综合征。7.2口服法感染的结果
7.2.1服法感染的检测组指示虾在患桃拉综合征的情况下，首次投喂后的3d~4d出现桃拉综合征的急性感染症状，在肯次投喂后的3d--8d死亡率明尼上升。7.2.2口服法感染的检测组指示虾出现急性感染症状符合SC/T7204.1--2007（对虾桃拉综合征诊断规程第1部分：外观症状诊断法)急性期发病症状的规定。7.3注射法感染的结果
7.3.1注射后数分钟内指示虾出现急剧死亡为“蛋白质休克”，是对虾血淋巴对接种物产生反应，出现全身性避固的结巢，说明接种物中含有过多蛋白质类的物质，应该避一步稀释，然后用来注射另外的指示虾。
7.3.2如果接种中有活性的TSV存在，在检测组接种后24h--48h，指示虾就开始出现死亡，病毒的剂量趣低，感染后开始死亡所需的时间就越长。A.ITN缓冲液
: NaCl
附录A
规范性附录】
试剂配方
.3.15g
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溶解于 800 mL:水,加人 1:mol/1, HICi调节 pH到 7.4,再加人水定容至 1 m00 mL高压蒸汽灭菌，室温存。
A.22%无菌盐水
加水溶解定容至
商压蒸汽灭菌，温存。
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附录B
【规范性附录】
水产病害诊断实验室感染性污染的材料和物品的处理方法B1感染性污染的材料和物品的范围水产病害诊断实验空为「逊行病害的诊断，需要对所诊断的病害的病原生物，在保持其活性的情况下，进行必要的处理、富集，浓缩或增值。在诊断实验先成后，产生可能携带有明品感染括性的该种病原生物的幸存的实验动物、实验材料、待清洗的实验用品或设备，暂养废水利废气等，都属于感染性污染的材料和物品。
病原牛物在诊断过程中已失去感染活性的情况不适了本规定。实验过程中若未引起有活性的病原生物发生沾污、富集，浓缩或增殖的情况不适于本规定。存在有非水生生物病原或人畜共患疾病的情况不适于本规定。
B.2各类感染性污染的材料和物品的处理方法B.2.1幸存的实验动物
少量小型率存的实验动物应该杀死，对于传染性弱或容易丧失感染性的水生生物病原，在户体上撒上含氯消剂粉末或用沸水浸烫，按普通垃吸处理；对于传染性强或耐受力强的病原，应将动物户体逊行高压蒸汽消毒，然后按曾通垃圾处理：大型实验动物成隔离暂养超过该病告的潜伏期的2倍时间，再按相关诊断规程所规定的方法进行诊断。在诊断不带有相成病原后.可在指定养殖场地养殖；岩表现出明显的病症，且仍帮有相应的病原，成该立即将其杀死，然后将」体梵化或在远高水产养殖或自然水的区域深埋，深埋坑内应没洒足够的含氯消毒剂；若大型实验动物处于可疑的潜伏带毒状态，而该病原对实验所在区划不构成威胁，可将该动物隔离养殖于该区划内的远离水产养殖区域或自然水域的地点；岩该病原对实验所在区划构成显著威胁，则应在确诊带毒后将该动物杀死，对户体进行梵化处理。B.2.2实验材料
感染性污染的实验材料，包括带有病原感染活性的实验动物户体，试剂、培养基、少量废水和一次性实验用品等。少量的小型实验动物严体、试剂、培养基、少量废水和：次性实验用品等，可采用经尚压蒸汽消毒后按普通垃叛处理。大批量的小型实验动物户体利一次性实验用品等可集中楚化盾普通垃圾处理；大批量试剂和培养基等含液量高的材料，可加人氯消毒剂至有效氟含最达20001rg/1.的浓度保持30min，然后按相应化学药品的废物处理要求处理；人批量废水参照B.2.4的暂养后废水的规定处理。B.2.3待清洗的实验用品或设备
用含有2000rr/L有效氯的含氯消毒剂的溶液清洗或擦净实验用品或设备的表而，并在该消毒剂溶液中浸泡或保持表面润龈5min，然后再用消水进行清洗或擦拭。对了不能经受上述浓度的含氯消毒剂腐蚀的实验用品或设备的表面，用3%的过氧化氢清洗或擦拭，然后再用清水进行游洗或擦拭！B.2.4暂养后的废水
暂养后的废水中加人含氯消毒剂，使有效氯浓度达到2000mg/L，保持30min，然后按曹通废水处理，名该废水不存在其他污染，可再加人硫代硫酸钠至2000mg/L浓度，搅拌混，散置10rrin后排放。
B.2.5气溶胶
SC/T 7204.4--2007
诊断有高度传染力的烈性水生生物疾病或其病原对干燥、紫外线等耐受力疆的水生生物疾病，不应该在邻近水产养殖或自然水域的地点逊行可形成带有大量感梁性污染的气溶胶的实验工作，如暂养时的人量充气。进行可形成大量气溶胶的实验，应在相应容器上覆盖防扩散薄膜，必要的倩况下在实验室用塑料薄膜做成临时隔断，增加气溶胶扩教的难度。在经常逊行该炎工作的实验室安装紫外线灯，定时用紫外线进行消毒。
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