SC/T 7205.1-2007 牡蛎包纳米虫病诊断规程 第1部分:组织印片的细胞学诊断法 SC/T7205.1-2007 标准下载解压密码：www.bzxz.net

ICS65.020.30
中华人民共和国水产行业标准
SC/T 7205.1--2007
牡蛎包纳米虫病诊断规程
第1部分，组织印片的细胞学诊断法Diaguostic Protocols for Bonamiosis of Oyster-Part 1: Cytological Method with Tissue Imprints2007-09- 14 发布
2007-12-01实施
中华人民共和国农业部发布
S/T7205《牡蜥包纳米虫病诊断规程》分为三个部分：-第1部分：组织印片的细胞学诊断法；…-第2部分：组织病理学诊断法；一第3部分：透射电镜诊断法。
本部分为SC/T720S的第1部分。
本部分的附录A和附录B为规范性附录：本部分出中华人民共和国农业部瀚业局提山，本部分由全国水产标准化技术委员会归口。SC/T 7205.1—2007
本部分起草单位：中函水产科学研究院黄海水产研究所、金画水产技术推广总站、深圳出入境检验检疫局。
本部分主要起草人：杨冰黄健、陈爱平、江育林、王崇明、下秀华、魏琦、刘莉。I
1范围
牡蛎包纳米虫病诊断规程
第1部分：组织印片的细胞学诊断法SC/T7205.1—2007
SC/T7205的本部分规定了牡蛎包纳米虫病组织印片的细胞学诊断法的原理、试剂与材料，仪器设备、操作步骤和结果判定。
本部分适用于现场或基层实验室对患病牡及其他贝类个体进行包纳来虫病的普查和初步诊断。2规范性引用文件
下列文件中的条款道过本标准的引用而成为不标准的条款。凡足注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括期误的内容）或修订版均不适用予本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方彻究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注H期的引用文件，其最新版本适用于本标痛。SC/T7202.1一2007斑节对虾杆状病毒病诊断规程第1部分：压片显微镜检查法SC/T7202.3—2007斑节对虾杆状病毒病诊断规程第3部分：组织病理学诊断法SC/T7205.3—2007特蛳包纳米山病诊断规程第3部分：透射电镜诊断法3原理
3.1牡蛎包纳米虫及其病理学特征包纳米虫病足而灶蛎包纳米虫（Bonarnia ostreae）、致死包纳米出（Barieamziaeritiaxsus）和普夫来小胞（Mikrocytus roughleyi）所引起的。包纳米虫主要寄生在宿主的血细跑细胞质内，也可在消化道的上皮细胞或问质细跑间游离存在，尤其在坏死的结缔组织中史易发现，有时在鳃和外套膜出现黄的色变和广泛的灰白色小溃疡病灶，但多数受感染的杜蛎外观正常。病灶先在鳃、外套膜和消化腺的结缔组织中出现，血细胞内的包纳米虫随着比数量剧增而很快扩散全身，出现浓密的血细胞漫润，最终导致牡娠死亡。包纳米出感染的病理学特征与受感染的宿主种奖和数量有关，包纳米出病在全年都时能发生，但其患病率和感染强度随季节变暖而增加。这两种包纳米出的潜伏期长达斤个月，用组织学的切片染色法或用细胞学的组织印迹法，在此期问可能检测不到感染。主．
牡蛎属(Qstreuspip.)、螺属（Tiosrex app-)和巨蛎属(Crassustrea spp.)的所有种可能都是易感宿3.2技术原理
通过光镜观察经告姆萨氏染液染色后的纽织印片，鉴别包纳米虫的形态和数量，从而初步判断被检样品是香感染包纳米出。
4试剂和材料
4.1除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。4.2中醇：
4.3性树胶，
4.4 Naci。wwW.bzxz.Net
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4.5吉姆萨氏染液按附录A的规定，4.6戴维森氏AFA(Davidson：AFA)固定液按SC/T7202.3—2007(斑节对虾杆状病毒病诊断规程第3部分：组织病理学诊断法)附录A的规定。4.73%戊二按SC/T7205.3—2007牡蛎包纳米出病诊断规程第3部分：透射电镜诊断法）附录A的规能。
4.81%酸接S/T7205.3--2007（牡蛎包纳米虫病诊断规程第3部分：透射电镜诊断法）附录A的规定。
4.90.22um滤膜，
4.10吸水纸，
5仪器设备
5.1显微镜：带高倍镜（40×）油镜（100×）。5.2载玻片。
5.3盖玻片
5.4解剖刀。
5.5镊子，
6操作步骤
6.印片制作
6.1.1祥品的采集按附录B执行。6.1.2取活体牡蛎的卵巢或心脏组织（心室)在载玻片上印迹，制成涂片，涂片白然干燥后在甲醇中商定5min--7mine空气干燥。
6.2染色
6.2.1将丁燥的涂片移入吉姆萨氏染液中染色，3张4张片子用不同的染色时间染色15min～50min作试样。
6.2.2染色后用缓慢的自来水流小心冲洗。6.2.3让玻片在率温空气中晾干。6.2.4中性树胶封片。
7结果判定
7.1在油镜下放大1000倍，搜索不同的视野进行检查，光镜下包纳米虫大小约2um～5um.在受感染的牡蛎血细胞内外均可见到。虫体细跑质呈啃碱坐，缅胞核旱嗜较性，组织印片法观察到的虫体比用普通组学染色斥观察刘的个体要大。7.2此寄生虫在亲本中主要感染上皮组织，心肌组织的印片不活用于对亲本的诊断。7.3诊断结果可疑时,补充组[病理学或透射电镜诊断法进行结果确认，2
A.1告姆萨氏染液
附录A
【规范性附景】
试剂配·方
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0.8g吉姆萨氏染料落了100nl.出等体积甘汕利甲醇组成的混合液中，以机械搬满器振荡2d-3d,或加入玻璃殊用于闻断摇动,共3d-4d。临用时将-4'mL青姆萨氏贮存液稀释于96mL的磷酸盐缓冲液中。
A.2磷酸盐缓冲液，pH6.8
0.067 mol/L NazHOa
0.067 mol/L KH,PO
A.30.067naol/LNa2HPO
Na2HPO
加水溶解定穿至
A.40.067 nol/LKH2PO4
KH,PO4
加水溶解定容至
1000mL
1000mL
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B.1用于评估健康状况的样品
B.1.1采样位点
附录B
（规范性附录）
软体动物疾病诊断的采样原则
对于每-个相关的区划，必须选择多个采样位点，从而增加诊断的可靠性。同时，必须说明“些与病原发展相关的参数，如放苗渐度、水流、软体动物的发育阶段等。对于任仰给定的这划，至少要用最切实可行的方法选择一个采样位点。对于包含易感种的数个不连续养殖区的区划，必须增加采样位点的数最，要从归生区域采样位点采集数个样品。可能的话，样品应该色括客利大小的个体，还成挑检表现出任何不正常（生长异常、壳松口、死亡率增加)的动物。B.1.2采样周期和频率
求样的时间和额率应出病原感染周期决定。产卵所，伴随衍主健康状况下降，病原的感染独度可能增加，建议进行产卵后的采样，采样周期还必须考虑动物一般在春季和秋季的迁徙。一年中至少成采样2次。
B.1.3采样数量
在对区域的健康忧况评估逃行核准前的最初两年期间，每一采样位点的样品数量最少要150只动物，或是满足在推测的检出率下达到95%可信限所端的群品数量（见SC/T7202.1-2007斑节对虾杆状病毒病诊断规程第1部分：压片显微镜检查汰附录B表B.1)。中于海上区划维待的难度，在随后的儿年中也应保持该采样水平，如果双壳贝类将从天然曾殖场移倒一个养殖点，或在不同区间的人然增殖场之间移动，出于寄生虫的感染率低，就必须采集大量的贝样。B.2用于诊断突发性异常死亡的样品B.2.1样品量
发性常死亡足指在短时间（15d)内发生的突然的大量死亡（死亡率超过15%）。进行突发性异常死广调查的样品采集必须包括100个·150个体，并按组织学和其他相关分析的力法处理样品。B.2.2样品运输
采集的样品立即置于冰上保存，同时防止没人冰水巾。所有的样品必须在采集后的24h内旱送到诊断实验室，以使其保待存活，包装外必须贴上标明采样编号、地点，养殖历史的标签。B.2.3组织固定
固定前要求去除双壳类的壳，以便让固定液易于渗人组织。小心打开贝壳，以免损伤软组织，特别是外套膜、鳃、心脏利消化腺。必须注意凯织的异常和病灶，以及任何贝尧的缺损、钻壳生物和外套膜内共生生物的存在。颜死动物或刚死（儿办钟之内）的动物最适于采集组织样品。对海洋软体动物进行组织学分析的样品摧荐vidsor，AFA固定液，细小的标本也可侦用成一醛固定液，从可与电镜观察兼穿。为了提高固定效采，固定液的体积应超出样品体积10倍以上。4
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组织学的标准切片成该穿过心脏，消化腺，并包措有鳃。对于人的标本，应该对不间部位进行切片对所有重要组织进行观察。
用于电镜观察的固定要在用于纠织学观察的商定之前迅速完成，只有从活体动物取的样品才有效。推荐的电镜固定液为3%的必二醛，固定时间为1h，过长时问的固定会导致膜结构的破坏，固定唇用缓冲液冲洗3遍，然后用1%俄较固定，心用缓冲液冲2遍。为了尽量减少对超微结构的破坏，样品应该使用与组织的渗透压相近的溶液处理，处理软体动物组织的溶液的渗透压应使用NaCI调节离子浓度为1000mmol/L左右：牡蛎组织与海水接近等渗，配制戊一醛溶液时可使用0.22m滤膜过滤的海水，并用这种海水进行随后的冲洗。
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