SC/T 7205.3-2007 牡蛎包纳米虫病诊断规程 第3部分:透射电镜诊断法 SC/T7205.3-2007 标准下载解压密码：www.bzxz.net

ICS65.020.30
中华人民共和国水产行业标准
SC/T 7205.3—2007
牡蛎包纳米虫病诊断规程
第3部分：透射电镜诊断法
Diagnostic Protocols for Bonaniosis of Oyster-Part 3: Transmission Electron Microscopy Method2007-09-14 发布
2007-12~01实施
中华人民共和国农业部发布
SC/T7205《牡蛎包纳米出病诊断规程》分为三个部分：-第1部分：组织印片的细胞学诊断法；-第2部分：组织病理学诊断法；第3部分：适射电镜诊断法。
木部分为SC/T7205的第3部分。
本部分的附录A为规范性附录。
本部分由中华人民共和国农业部渔业局提出。本部分山全国水产标准化技术委员会归口。SC/T 7205.3—2007
本部分起草单位：中国水产科学研究院黄海水产研究所、全国水产技术推广总站、深圳出人境检验检度厨。
本部分主要起草人：杨冰、黄徒、陈爱平、汀育林、王崇明、王秀华、魏琦、刘菊。1范围
牡蛎包纳米虫病诊断规程
第3部分：透射电镜诊断法
SC/T 7205.3—2007
SC/T7205的本部分规定了杜包纳米虫病透射电镜诊断法的原理、试剂与材料、仪器设备、操作步骤和结果判定。bZxz.net
本部分适用于对疑似包纳米虫病样品的确诊和组织细胞的超微病理学评价。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用面成为术标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随前所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓动根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用」本标准。SC/T7205.1—2007牡蛎包纳米虫病诊断规程第1部分：组织印片的细胞学诊断法3原理
3.1牡蛎包纳米虫及其病理学特征见SC/T7205.1—2007(牡蛎包纳米虫病诊断规程第1部分：组织印片的细胞学诊断法）中3.1的规定。
3.2技术原理
通过透射电镜观察被检组织超微结构，分辩包纳米虫的精细形态，从而确诊被捡样品是否感染包纳来虫。
4试剂和材料
4.1除非男有说明，在分析中仅使而确认为分析纯的试剂和蒸馅水或么离子水或相当纯度的水，：4.2海水。
4.3无水乙醇，
4.495%乙醇。
4.5环氧树脂(Epon 812)。
4.6环氧丙烷
4.7氧化丙烯。
4.8合成树脂。
4.9碱性甲苯胺蓝（Toluidinc blue);生物染色剂4.1070%乙醇按附录A的规定。
4.113%戊醛按附录A的规定。
4.121%饿酸按附录A的规定。
4.13Epun812包埋剂配方按附录A的规定。4.14柠檬骏铅染色液配按附录A的规定。SC/T7205.3—2007
4.15醋酸铀染色液配方按附录A的规定：5仪器设备
5.1 电了显微镜。
5.2超薄切片机。
5.3铜网
5.4载皱片。
5.5盖玻片。
5.6解剖刀。
5.7镊了。
6操作步骤
6.1固定组织块
6.1.1样品的采集要求见SC/T7203.1一2007（牡蛎包纳米虫病诊断规程第1.部分：组织印片的细胞学诊断法)附琴B.
6.1.2对平电镜观察的组织块，秉要的是正确地进行固定以使超微结构尽可能少受到破环。把样品切成大小不超过3nn~·4mI的小块.以使固定逆速惨透样品中。6.1.3用3%戊二醛固定样晶1h（4℃），固定时间过长会导致膜状结构变形，再用经0.22m滤膜过滤的海水洗3次，1%的钱酸固定（1h).再用过滤的游水洗2次6.2脱水和包埋
6.2.1脱水：样品浸人系列不同浓度的乙醇中脱水：70%乙醉1次（15mim），95%乙醇2次（各15min），无水乙醇3次（各10min），无水乙醉：环氧丙烷（1:1）1次。最后换2次环氧丙烷（各15min）完成脱求过程。
6.2.2样品逐步浸透：首先将样品置于氧化丙烯一环氧树脂50/50（V/V）的混合物巾，小放入环氧树脂中。浸泡的时间越长，组织块被浸透得越好（1d布右）6.2.3包埋：将样品置于感满环氧树脂的模真进行包埋。在每个模快上做好标记，然后在60℃下作用48h。
6.3切片和复染
6.3.1先用刀片把树脂块切成适当大小，然后用超薄切片机切片。先切-些0.5um11um的半薄切片放在载玻片上。这些切片用光镜检查以控制样品的质量，并通过它们找到切片上值得证意的区域。这些半薄切片于00℃-100下用［%（碱性)莱腰蓝染液染色，染色后加-滴个成树脂用盖玻片片，在光镜下观察。
6.3.2在超薄切片机上切取80mm--100un厚的超薄划片，捞取到铜网上，用满暖钟和存檬酸铅复超薄珂片：
6.4透射电镜观察
7结果判定
7.1致死包纳米忠（Boamxaertiosus）的原生质形态大小为4.0pm~4.5um,其细胞和细胞梭的轮廊不规测，定形的细胞质包含体（多泡体）和高尔基休祥光面内质网的排列，其中间的细胞质形态的密度要比原生质的大，但直径稍小-些（3.0um~3.5um）。单跑子体在高尔基体/核质复合物中形成，在结构上与某些病毒有点类似。2
SC/T 7205.32007
7.2牡娠包纳米虫（Bnnamzia ostreare）利致死包纳米虫（Boumiaeritins）的区别是，包纳米出（Bomaumiacstreue）具有较少的单孢子体、线粒体和密集类脂体，且核质比较小7.3包纳米虫（Bomamiua.spp.)和马町尼小跑虫（M，muckini）的区别是，马可尼小胞出的核仁位核中央，缺少线粒体：而包纳米虫核仁位置有较大的差别。3
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A.1 70% Z醇
无水乙醇
加蒸馏水30mL,定容至
A.23%戊二醛
25%戊一醛水溶液
海水（经0.22um滤膜过滤）定穿至A.31%酸
附录A
(规范性附景）
试剂配方
将0.5装钱酸安颜施外壁用肥启水清洗下净后，放洗液中浸泡4h-6b，并冲洗干净，用清洁的玻棒将洗净的酸安颜瓶夹起，置于有色磨口试剂瓶中，盖紧瓶塞，用力振动试剂瓶以撞碎酸安部瓶，这时文即加入事先备好的50ml.双蒸水。将配好的钱酸溶搬试剂瓶放于封闭的十燥器小，放在0℃--4℃C冰箱内让其缓缓溶解备用。酸溶解缓慢必须于用前数H配制，所用容器以肥皂水洗净后必须用洗液浸泡、蒸馏水冲洗干净后方可使用，因为钱酸是强氧化剂，如有杂质即可发生反应使其还源变成黑色火丢固定能力。我酸极毒，一般封闭于.5g--1区安颜瓶量,其蒸汽也有固定作用,对于人的眼哨角膜、表皮细胞、晕腔和!1腔膜表皮细胞特别有害，使州时放特别小心，必须在通风条件下操作，A.4Epon 812 包埋剂
Epon812（环氧树脂）
DDSA(十二烷基琥珀酸酐)
MNA(甲内茨甲基四氢苯二峻酐)
DMP-30(2,4,6-—甲氮基甲基茉龄)A.5柠檬酸铅染色液
硝酸铅【Ph(NO2]
柠檬酸钠N（）210
加水兹
10~12滴
间源地摇动30 rrin唇,加人8rL NaOH（1mol/L）此时乳凹色混浊液即变为透明溶液,井籽溶波稀释至5 ml,plI药12.染色5min--10 nin。1.6醋酸染色液
醋酸铀
50%酒精
100 mL
染色20min--30min
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