SC/T 7202.1-2007 斑节对虾杆状病毒病诊断规程 第1部分:压片显微镜检查法 SC/T7202.1-2007 标准下载解压密码：www.bzxz.net

ICS 65.020.30
中华人民共和国水产行业标准
SC/T 7202.12007
斑节对虾杆状病毒病诊断规程
第1部分：压片显微镜检查法
Diagnostic Protocols for Penaeus monodon-Type Baculovirus(MBV) ofPenaeid Shrimp
Part 1: Microscopy Method with Wet Mount2007-06-14发布
2007-09-01实施
中华人民共和国农业部发布
SC/T7202《斑节对虾杠状病毒病诊断规程》分为三个部分：第1部分：压片显微镜检查法；
第2部分：PCR检测法；
第3部分；组织病理学诊断法。
本部分为SC/T7202的第1部分
本部分的附录A、附录B为规范性附录。本部分由中华人民共和国农业部渔业局提山。本部分由全国水产标推化技术委员会归口。SC/T 7202.1—2007免费标准下载网bzxz
本部分起草单位：中国水产科学研究院黄海水产研究所、全国水产技术推广总站：本部分主要起草人：黄健、杨冰、陈爱平、宋晓玲、史成银、杨丛海、魏蔬。1范围
斑节对虾杆状病毒病诊断规程
第1部分：压片显微镜检查法
SC/T 7202..1--2007
SC/T7202的衣部分规定了斑节对虾杆状病毒病床片显微镜检查法的原理、试剂与材料、仪器设备、操作步骤和结果判定。
本部分适用对虾活体及其粪便中的斑节对虾杆状病毒(MBV)核型多角休的检测，其中对粪便的检查可用于进行非致死性的疾病筛查和诊断。不适于对病毒非感染性携带的标本进行诊断，以及对宿主逊行组织病理学评价：
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注口期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用丁本标雄，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注口期的用文件，其最新版本适用不标准。SC/T7202.3—2007斑节对虾杆状病毒病诊断规程第3部分：组织病理学诊断法3原理
3.1斑节对虾杆状病毒病的病原和病理学特征现SC/T7202.3—2007(斑节对虾样状病毒病诊断规程第3部分：组织病理学诊断法)中3,1的规定。3.2通过光学显微镜观察新鲜组织样品或粪便中近球形的MBV核型多角体形戒的情况，可初步诊断被检样品是否感染MBV。直接压片法是利用包涵体较高的折射率进行区分，孔雀石绿染色法足利用包涵休着色较深区分，压片焰红染色法是用荧光微镜观察经焰红染料染色的包潮休激发出的荧北来判断，
4试剂和材料
4.1除非好有说明,在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水。4.20.05%孔雀石绿染液接附录A的规定。4.30.001%焰红染液按附录A的规定。4.4白然游水经沉淀去除悬浮物。5仪器设备
5.1显微镜：压片孔雀石绿染色法只需要普通明视归显微镜即可，直接压片法推荐使用相差显微镜，压片焰红染色法需要荧光显微镜（阻挡滤光片波长为520mm，激发滤光片波长为450mm~490mn）。5.2载玻片，
5.3盖玻片。
5.4医用镊子。
5.5解剖刀。
5.6水族箱。
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5.7塑料虹吸管并接有一段塑料吸管尖头，5.8玻聘试管。
5.9吸水纸，
6操作步骤
6.1样品的准备
6.1.1样品采集的要求见附录B
6.1.2组织样品：幼休取整体，仔虾取头胸部，幼虾和虾取小块肝映腺或小截耳肠组织。6.1.3粪便样品：将幼虾或成虾暂养水族箱巾，待数小时壹至水族箱底部出现粪便，用十净的塑料虹吸管吸取排泄物,注人瑕璃试管中。6.2直接压片法
将组织或粪便样品置于玻片上，用解刀将样品划碎，盖上盖玻片，用明视野显微镜调小光圈观繁,或用相差显微镜观察。
6.3压片孔雀石绿染色法
将组织或粪便样品置于裁玻片上，用解剖刀将样品切痒，滴加1滴～2滴0.05%孔雀石绿架皴，混匀，染色2min-4min，盖上.盖啵片，用吸水纸吸取多余的液体,将制备好的压片置于明视野显微镜下观察。
6.4压片焰红染色法
將纽织或粪便样品置于载玻片卜，用解剖刀将粹品切碎，滴加1滴～2滴0.001%焰红染,混勺，染色2main～4mi1,盖上盖玻片，用吸水纸吸取多余的液体，将制备好的压,片置荧光显微镜下观察。7结果判定
7.1直接压片法：显微镜可观察到受MBV感染的对虾肝胰腺或中肠的上皮细胞核肿大，核内有单个或多个折射率高的球形包涵体,单个包極体直径约为0.1μm~20un。受MBV感的对虾粪便压片可观察到带折光性的近似球形的包涵体，大小约20um，在新鲜粪便中，MBV包涵体常成团策集，并被核膜包着。
7.2压片孔雀石绿染色法可观察到包涵体着色发绿，与正带的绝胞核、核仁、分泌粒或吞噬溶酶体和脂助滴等具他球形体相，包瓣体荐色史探。7.3压片焰红染色法在荧光显微镜下可见到在浅绿色的背累中，核型多角体的包涵体翌明亮的黄绿色荧光，而组织中的其他成分没有费光。7.4观察结果找到多个有人量或發集的典型包涵休的视可作为确诊的依据；诊断结果叮疑时，补充组织病理诊断法或 PCR检测逊行结果确认：2
A.10.05%孔雀石绿染液
孔雀行绿（水溶性)
附录A
(规范性附录)
加水溶解定容至室温贮存。
A.21%焰红贮存液
焰红B（水溶性）
溶解后置丁棕色瓶中,室温贮存
A.30.001%焰红染液
1%焰红贮存液
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100 mL
100 mL
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B.1采样目的
（规范性附录）
甲壳类动物疾病诊断采样原则与方法甲壳类动物的疾病诊断通常出乎三个目的之一：疾病流行状说的监测：②种苗或场地的链康证书；③疾病发生后的诊断。对丁不同日的进行分析，所需的样品类型和数罩被不相同。B.1.1疾病发生后的诊断
在临床发病的情况下，应该从活的或濒死的甲壳炎动物中了细选择带有特征性病灶的商质量标本，强调标本应具有代装性，并且足额死的或临床发病的：避免采集死后的标本，采样时要恨据诊断方法，考虑样品所需的保存条件。
要对已发生的疾病进行诊断，建议最少采集100个幼体标本，50个后期动体（如仔虾，仔蟹）标本10个猎体（如幼虾稚）或成体（如成虾，亲等）的标本。如果临床病症明显，可采集更多的数量。不过，上述推行的\最少\数量只是一个指导性的参考量.必须泄调，仔细选择标本的质量比随便捡出上个标本来充数要更有价值得多。B.1.2 对无症状的甲壳类动物的诊断要监测疾病流行情况、或检测无症状感染的病原、或核难健康证书，所需的采样数量就应该用统计学为法来确定。先假定感染的检出率人十或等于2%5%、10%，20%等，同对不间人小的群体计算所需的最少样品数量，该数最成该能使样品中出现感染标本的概率满足95的的可信限：对不同大小的群体，所需要的采伴数量已被计算成预定的表格(见表B.1)。为了监测疾病流行或核准健康证书，对不同大小的群体逊行诊断所需的样品数量应与表1相符，并取其最低的假定检出举、即2%，为了诊断群体中似乎存在的尤症状感染，可假定检出率高丁5%，从表1查出所需的采样数量。表B.1
各种大小的群体在推测病原检出率不同时满足95%可信限的采样数量群妹大小
100000
各假定检山率的采样数量
济：表格中的采样数量是指实际被有效分析的样品数，如果所采集到的择品不一定每份都能分析到，则需采集更多样品。例：对于100000能行虾的群体求说，在60尾样品中查出3尾附件，则该群体荐在5%废原检出率的结果只有05%的可信度
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对不同病原的监测，还应注意最适于采样的生活期有差异。例如，要监测对虾杆状病孝病、斑节对虾杆状病毒病或杆状病毒的中肠腺环死，最伴采样期是幼体和早期仔虾；要监测拖拉病、白斑病和黄头病，最佳梁样期是幼虾和亚成年虾；要监测鳖虾瘟，最佳采样期是幼螯卧虾和成年虾。B.2不同诊断方法所需样品的采集要求B.2.1直接显微镜检查或组织印片/涂片染色检查的样品用于直接镜检的样品应在采集后立即处理，起码要求能做到制备好风干的组织印片或涂片。待检样品尽可能使用活标本，如果得不到活标本，至少也应使用冰鲜或用缓冲的10%甲醛（37%）同定的标本。
：B.2.2组织学诊断的样品
B.2.2.1采样时样品要求
采样时，应尽量减轻对动物造成的胁迫，固定前需要运输或临时暂养时要保证水中有充足的含氧B.2.2.2固定液要求
雅备好充足的固定液，一般原测是一体积的组织样品最少需要十倍体积的固定液（例如，10对虾组织需要100mL固定液）
大多数组织学诊断都可使用識维森氏AFA固定液（见附录A)：该固定液可快速渗透，龍有效阻止中壳类的组织自溶，且其酸性可使甲壳脱钙。如果样品要准条进行免疫组织化学分析或进行RNA病毒的原位杂交诊断，可采用非酸性的R-F固定液（见附录A)。但R-F固定液不应该用常规组织学样品的固定，因为它对组织的参透较慢，月不能使中壳脱钙，用它固定的组织可能会导致切片和染色困难。B.2.2.3不同样品的固定方法
幼体利仔虾：用细筛组或吸管选取标本。将来集的个休直接没人10倍体积的固定液中，固定12h～24h，然后转移到70%乙醇中长期保存大的仔虾利小的幼虾：按上述方法逸取并采集标求。用注射针炎或解剖刀尖划被甲壳，将采集的个体直接浮人10倍体积的固定液，固定12h～24h，然后转移到70%乙醇中长期保存。大的幼虾以及成虾：用注射器将体重5%～10%的固定液注射到活虾体内。先对肝腺区域分2处3处进行江射，然后将固定液注射到第1、第3和第6腹节。头胸部，特别是肝胰腺区应该多注射一些。准射使虾完全死亡，然后立即用解剖刀片划开用充；在头响区的划口沿着头胸甲中线的右侧，在腹节区的则口沿着腹节右侧的中部。再将个体浸入10倍体积的固定液中，定24h；然后转移到70%乙醇中长期保存。
体重大门12的虾或蟹：按上述方法注射并划破甲壳，然后将虾体在头胸和腹节连接处的后面横切，如果虾体较大，再在腹节中部横切。将各部分浸人10倍休积的国定没中，固定24h，如果个体较大或甲壳较硬，应延长固定时间，直到72H，然后转移到70%乙醇中长期保存个体很大的虾或蟹：注射商定液后，对个体解剖，取山需要进行组织学分析的组织或器宫，分别浸人10倍体积的固定液中，固定12h~24h，然后转移到70%乙醇中长期保存。B.2.2.4样品编号.登记和标签
在采集样品时应对标本进行编号和登记，并批编令记载标本的全部说明档案，包括标本种名、龄期、重或大小、米源、个体症状、群体健康状态以皮其他相关信息，要便使用抗水的纸条或毛面塑料纸做样品标签，并用B2铅笔在标签上注明标本登记编号及其主要说明，将标签直接放人与该标本相同的含固定液包装中，不要用钢笔、圆珠笔或记号笔作标签。，B.2.2.5样品的包装和运输
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大体积的固定液或含之醇溶液不能进行邮寄或运输，样品运输前需耍逊行相应的处理，在运输前12h，将样品从70%乙醇中转移到50%的乙中保存，以降低样品中的之停含量。包装前将样品从50%乙醇中取山。幼体、仔虾或小的幼虾标本转移到具密封圈的螺口案丙烯塑料管中，放人标签，再填充少许吸水纸，然后用50%乙醇漫透，盖紧管竭；较大的标本用3层5层白色纸巾完全包裹，将纸而包恶的标本放入个厚的聚丙烯塑料袋中，用50%艺醇没透纸巾，在袋内放人标签，将塑料袋用热塑封口机烯封。将上述塑料管或塑料袋用2层吸水纸包裹，放人一个厚塑料袋中并完全密封。多个小塑料袋再到人一个较大的塑料袋内，殿后所有的塑料袋放人一个抗压的运输用包装箱内，填人防压充填物，进行邮奇成运输。
B.2.2.6组织学标本修整的取材
从50%或70%的乙醇保存液中取出周定好的标本，置予木头或塑料垫板上，根据标本的大小进行修整，以便确保感兴趣的组织能被有效切片。纱体或虾：用擦镜纸将个休包好，放丁脱水盆中进行脱水，包埋时去掉擦镜纸，用热镊子调整标木在包厘模其中的惊置进行整体包现：小于3cI1的幼虾：用单面刀片或解部刀沿对虾的中线右侧将标本纵剖两半。如果虾体较长，可从第2腹节处横切两半。取包含中线的左侧进行脱水，包埋时纵切面向下包埋。大于3CH1的幼虾或亚成虾：用单面刀片或解剖从对虾的头啊和腹节连接处切断，再将头胸沿中线右侧纵剖两半。取包含中线的左侧，切去步足以%的长度，副净骨内容物；如果头胸长度大于1cm，切取包含胃部和肝胰腺部分的1cm以下的部分；如果厚度大于0.5cm，削去高出0.5cm的部分，再从不含中线的右侧头胸部斜切下鳃区。将切取的含中线左侧头胸部和切下的鳃区放人间一个脱水盒进行脱水，包理时将含中线左侧头胸部的纵切而向下，鳃区的纵切面问上，前后对错地放人同一个包埋模其中包埋，如果需要对腹节部分进行组织学分析，选取感兴趣的腹节或第1、第3和第6腹节，从第1和第3脱节横切山厚度不超过0.5cm的段，刘第6腹节纵切，分别脱水和包。大于8cm的虾或蟹：参照上述修整方法，按照长宽不超过1cm×1cm厚度不超过0.5cm的要求，对感兴趣的织所在这域进行修整；对特定的组织或蟹的组织，也可考感进行横切，湛至独立地解剖出相应的组织器官，按需婴分别进行脱水和包螺，胃和肠道中的内粹物应剔除干净以免损伤切片刀。B.2.3分子生物学或免疫学诊断的样品B.2.3.1样品采集和保存要点
用于PCR.RT-PCR或核酸探针斑点杂交检测的样品，应该注重保护病原的核酸；用抗体的免疫分析检测的样品,应该注重保护病原的抗原活性。用于核酸检测或抗体检测的样品，应该「分小心地防止各样品间的交叉污染，每个样品必须使用新的一次性塑料袋或塑料管和内置标签：不同的样品采集和保存方法，对不同检测方法的适用性有差异，并几可能要增加些辅助的样品处理手毁，因此在样品采集和运输时要注明曾使用过的保存条件，使实验室能据其保存条件进行相应处理。
B.2.3.2不同类型样品的采集和运输B.2.3.2.1活标本：活标本可在现场处理或以活体形式输到诊断实验室。B.2.3.2.2血淋巴：许多分于生物学或免疫学检测的首选样品足血淋巴，样品可用注射幕从心脏、腹部血实采集，或划断附肢采集，B.2.3.2.3冷藏标本：需经24h以内运输到实验室，进行分于生物学或免疫学检测的样品可采用这种力法保藏。迄输前，应将各样品独立装袋，用足量的冰将样品塑料袋埋入泡沫塑料箱中，进行合适的包装后运输到实验究，
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B.2.3.2.4深冻标本：采集活标本，用于冰或用低于-20℃的冰柜速冻，将标然放人独立的样品包装裂，用足量的干冰将样品包装製埋人范沫翌料箱中，进行合适的包装后可满足较苛刻的运输要求。B.2.3.2.5乙醇保存的样品：对于难以用冷藏或冷冻方法存放和运输样品的情况，可用90%~-95%的乙醇来保存和运送某些类型的样品。小丁2名～3g的个体、解出的组织或抽取的而淋巴可保存于90%~95%的乙醇中，做好相应标签，运输前1h，将保存的标本转移到50%的艺醇中，然后按本附录B2.2.5的方法进行包装和运输。
B.2.3.2.6特殊采样被保存的样品.…些特定的分子生物学或免疫学检测方法或试剂盒提供了样品的采集、保存和运输用试剂，可为样品的保存、运输和后续的检测操作提供便利。如SEMP-SSC采样液可用于斑点杂交检测的核酸样品的保存和运输，SEMPTris采样液可用于PCR和核酸探饣检测的核酸样品保存和运输，TrizolTM可用于RI-PCR样品的保存和运输等。但要往意，不同的采样液保存的样品通常只适用」该试剂指定的检测方法，而所不定适于进行其他的诊断，
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