ICS 65.020.30 B43 DB65 新疆维吾尔自治区地方标准 DB65/T 3810—2015 乳用马分子标记辅助选育技术规程 Technology Procedures of Marker-assisted Breeding in Dairy Horse 2015-10-15发布 2015-12-01实施 发布单位：新疆维吾尔自治区质量技术监督局 前言 本标准根据GB/T 1.1-2009《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写》要求编写。 本标准由新疆维吾尔自治区畜牧厅提出并归口。 本标准由新疆农业大学负责起草。 本标准主要起草人：刘武军、丁茜、邵勇钢、王琼、莫合塔尔·夏甫开提、努孜古丽·图尔荪、耿明、王军、何美升、刘玲玲。 1 范围 本标准规定了乳用马产奶量性能PRLR基因分子标记辅助选育的仪器设备及试剂、溶液配制、引物序列及操作技术规程等内容。 本标准适用于乳用马产奶性能的DNA分子标记早期选育。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2.1 检测时间（testing time） 分子标记选育技术在乳用马周岁时进行。 2.2 引物（primer） 用于DNA片段聚合酶链式反应扩增的人工合成短核苷酸链。 2.3 基因型（genotype） 生物群体中由于遗传差异而形成的不同遗传类型。 3 仪器设备及试剂 3.1 仪器设备 高速台式冷冻离心机、电泳槽及电泳仪、电子天平、凝胶成像仪、-20℃冰箱、水平摇床、移液器、PCR仪、微波炉、高压灭菌锅等。 3.2 试剂 Tris碱、硼酸、EDTA-Na2·2H2O、DL2000 DNA Marker、50 bp plus DNA Marker、NaOH、NaCl、氯仿：异戊醇（24:1）、无水乙醇、70%乙醇、SDS、二甲苯氰、溴酚蓝、去离子甲酰胺、Mix、6×Loading Buffer、丙烯酰胺、N,N-亚甲基双丙烯酰胺、AgNO3、琼脂糖、超纯水、尿素、溴化乙锭、TEMED、过硫酸铵、甲醛等。 4 溶液配制 溶液配制方法参照《分子克隆实验指南》。 5 引物序列 PRLR1：5'-TTTCATGCGTTATCCAAGCA-3' PRLR2：5'-GAAGGGCTTAGTTACGGGAAA-3' 6 操作技术规程 6.1 基因组提取 基因组DNA提取等技术参照《分子克隆实验指南》。 6.2 PCR扩增 采用PCR仪进行扩增。PCR反应体系为20 μL：DNA模板1.0 μL，PCR Mixture 10 μL，上、下游引物（10 pmol/μL）各0.5 μL，加双蒸水至20 μL。 反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，退火30 s，72℃延伸1 min，循环35次；72℃延伸10 min后4℃保存。扩增产物采用2%琼脂糖凝胶电泳检测，选择条带清晰且无杂带的PCR产物用于后续分析。 6.3 SSCP检测 采用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR产物，经银染显色后，用凝胶成像仪进行成像分析。 6.4 基因判型 根据基因型示意图进行判定。AA为乳用马产奶性能基因（PRLR）纯合体，AB为杂合体，BB为突变纯合体。 6.5 标记辅助选择 根据基因分型结果确定选留个体。在周岁个体鉴定时，应结合家族产奶系谱资料进行选择，对存在重大缺陷或不良性状的个体不予留用。