ＧＢ／Ｔ１５８０５《鱼类检疫方法》分为7个部分，本部分为ＧＢ／Ｔ１５８０５的第２部分。本部分代替ＧＢ／Ｔ１５８０５．１—１９９５《淡水鱼类检疫方法 第一部分》中的第４章。 ＧＢ／Ｔ１５８０５的本部分规定了用逆转录?聚合酶链反应(ＲＴ?ＰＣＲ)检测传染性造血器官坏死病毒(ＩＨＮＶ)的方法。本部分适用于ＩＨＮＶ 的分离与鉴定，ＩＨＮ 的流行病学调查、诊断、疫情监测，以及口岸出入境、国内跨区域移动的检疫。 本部分与ＧＢ／Ｔ１５８０５．１—１９９５的第４章相比主要变化如下：———增加了用ＰＣＲ 方法鉴定ＩＨＮＶ；———增加了资料性附录“ＩＨＮ 病毒Ｎ 基因的全序列(１１７６ｂｐ)”；———结构格式按ＧＢ／Ｔ１．１—２０００的规定，作为部分编写。 GB/T 15805.2-2008 鱼类检疫方法 第2部分：传染性造血器官坏死病毒(IHNV) GB/T15805.2-2008 标准下载解压密码：www.bzxz.net

ICS 65. 020. 30
中华人民共和国国家标准
GB/T15805.2—2008
部分代替 GB/T 15805.1—1995
鱼类检疫方法
第2部分：传染性造血器官坏死病毒(IHNV)
Quarantine methods of fish-
Part 2 : Infcctious haematopoietic necrosis virus(IHNV)2008-07-31发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2008-11-01实施
GB/T15805鱼类检疫力法》分为下列部分：第1部分：传染性膜脏坏死病毒（IPNV）；言
第2部分：传染性造血器宫坏死病毒（IHNV)；·第3部分：病毒性出血性败血症病毒(VHSV)：第4部分：斑点叉尾病毒（CCV）：第5部分：鯉春病菌血症病毒（SVCV)，一第6部分·杀鲑气单胞菌，
一第7部分：脑粘体虫；
本部分为（G/T15805的第2部分
GB/T 15805.2-—2008
本部分代替GB/T15805.1-1995&淡水鱼类检疫方法第部分中的第4章。本部分与GB/T15805.11995的第4章相比主要变化如下：增加了用PCR方法鉴定IHNV；
一增加了资料性附录\IHN病毒N基因的全序列(1176bp)\；一结构格式按GB/T1.1—2000的规定，作为部分缩与。本部分的附录A为规范性附录，附录乃为资料性附录。本部分由中华人民共和国农业部提出。本部分由全国水产标准化技术委员会归口。本部分起草单位：农业部全国水心技术推广总站、和华人民共和国深圳出人境检验检疫员。本部分主要起草人：孙喜模，江育林、陈爱平、陈辉、朱泽间。本部分所代替标雅的历次版木发布情况为：-GB/T15805.1—1995。
1范围
鱼类检疫方法
第2部分：传染性造班器官坏死病毒(（IHNV)
GB/T15805.2—2008
GB/T15805的本部分规定了用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测传染性造血器宫坏死病萨（IHNV)的方法：
本部分适用于IHNV的分离与鉴定，IIN的流行病学调查、诊断、疫情监测，以及口岸出人境，国内跨区域移动的检疫，
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过GB/T15805的本部分的引用而成为本部分的条款。凡息注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容)或修订版均术适用于本部分，然面，鼓励根据本部分达或协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注月期的引用文件，其最新版本适用于本部分。GB/T6682—1992分析实验室用水规格和试验方法（neq1SO3696：1987)GB/T18088-2000出入境动物检疫采样3试剂和树料
3.1IHNV参考毒株：由农业部指定的动物病原微生物菌（毒）种保葱机构提供，3.2水：GB/T6G82—1992，一级，并要用您碳酸二乙(DEPC)处现，除去DNA和RNA酶，3.3Taq嗨：一20℃保存，不要反复冻融或温度刷烈变化。3.4转录酶AMV：-20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化：3.5RNA酶抑制剂(Ranase）：一20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化3.6NTP(含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各10mmaI/L)。3.7引物：所选取的基因为IIINV的N基因中的片段，两对引物，浓度为40moL/L，F1和R1扩增该基因中的786bp片断，iF2和R2则从786bp片断中再扩增323bp片断。上游弓物 F1: 5'-TCA-AGG-GGG-GAG-TCC-TCG-A-3';下游引物R1：5'-CAC-CGT-ACT-TTG·CTG-CTA-C-8'上游引物 F2: 5'-TTC-GCA-GAT-CCC-AAC-AAC-AA-3';下游引物R2：5'-CCG-CAC-AGT-GCC-TTG-GCT-3'，3.8无水乙醇：分析纯，使用前预冷到一20℃。3.9矿物油：分析纯，
3.10溴酚蓝。
4仪器和设备
4.1PCR扩增仪。
4.2电仪。
4.3紫外透射仪，
4.4普通冰箱。
GB/T 15805.2—2008
4.5超低温冰箱。
4. 6 台式离心机
屯子天平，
低温高速离心机。
4.9微量移液器及吸头。
恒温培养箱：
电动勾浆器，
4.12剪刀,镊子。
4. 13离心管和 PCR管
组织研磨器。
倒置显微镜。
5IINV的分离
5.1采样
按GB/T18088-72008的规定
囊的鱼应去掉卵黄囊
无症状的鱼吸肝、熟雌鱼
5.2样品处理
应在10℃以舞象。先用组
聚前未用抗
终稀释度忌浮。
(10001U/mL的
4 h或 4 ℃下孵育
和000
21 h.7 00
用相同的力法离室
邹第液样品并在
5.3IHNY分离
对上述1：10双
111000三种稀磨虚
孔2cm)的细胞单
15℃~18℃培养。
飘萄浆「淀
清液，以适
接种10
阳性对照组和待测释影
链游素或其他抗菌业
养液再
4cm的鱼苗敏整条，若是带卵黄
大于6的鱼则肝、肾、脾。对
养液（见第，1掌）按1：10的最勾浆后博悬于含有抗菌素
培养液中，15c下孵育2h~
卵巢液不勾浆稀释两倍以上。
释，然后將这鼠：10、1：100和EPC或磨FHM细胞单层中，每
」h后加人胞培养液：置于
攀种细胞后，7d内每天用40倍到100倍叠显微镜检查，接种了被检物勾浆上清稀释液的细胞培暴串出现细胞病变（CPE>。如果除对照细疤外，没有CPE山现，则在培养7d后还要用嫩感细胞进有橋代培养。传代时，冻融并收集接种本组织勾浆上清帮释波的细跑单层培养物。7000r/min，4离心15i收集上清液婴种到新群细胞单层，培养7d，每天用10倍到1.00倍倒置显微镜检查。如果样品经过接种细胞和育传质树没有CPE山现，则结果判为阴性。如有CPE出现，则要用PCR方法妞行鉴是整季中IHNV起姐果在阳性对照组也来出现CPE，则试验无效。应采用敏感细跑和批新的组织样品重新按上述方法进行病毒学检查，
6IHNV的监定
6.1采样
对有临床症状的鱼，可以按照5.1的要求取样直接做R.T-PCR检测鱼组织}t是否有IHINV的核酸而对无症状的鱼，则应接种细孢，分离到病后再用RT-PCR鉴定是否存在IHNV6.2样品处理
如果是鱼样品，取不多于100mg组织。先加人150μLCTAB液（见第A.2章），用组织研磨器2
TTKAONTKAca-
GB/T 15805.2—2008
将样品匀浆成糊状，敢人1.5mI的离心管中，再将CTAB溶液补加至900uL，如果是有CPE的细胸悬液，则取450细胞忌液加入450μLCTAB溶液混勺。25C作用2.5h。6.3RNA 抽提
将处理好的样离心管中加人600μL抽提液2（见第A3章），用力混合不少于30s。12000r/min离心5min，小心取上层水相（约800u）：再加入700μl.抽提液1（见第A4章），用力混合不少于30s。12000r/min离心5min，小心取上层水相（约600μL）。再加人一20C预冷的1.5倍体积的无水乙醇约900μE，例置数次混勾唇，一20℃8h以上沉淀核酸。12000/tnin离心30min，小心弃去上清液。于爆后加10 μI.水溶解后作为RT-PCR模板。6.4变性和退火
在 PCR管中加人 10 μI.模假和 2. 5 μL引物,RL加 2. 5 μL永值总体积为 15 μL。置于 70 ℃反应5min。立即冰浴，低速离心药5s，将激收集在麻部。6.5CDNA合成
在上述反应管中
：5μl.的5倍逆转录酶浓缩缓冲液×buer)（见第A.5章）、2μLdNTP.0. 5 μL RNA剂<20
42 ℃ 60 min
6.6PUR扩增
在上述反应
镁8μ(见第
爱应以合成模
继续加人
100 L。每管埠
uL矿物
颈变性 4 min.
6.7琼脂糖电
用 TBE 地
C 1 min
中液（见第
板放入水乎电漆霜，
句后加人样品我，
5V/cm电泳约
6. 8 套式 FCR
如果 PCR 后鼠
熨电泳缓冲
电泳时设文
黄溴龄蓝创
泳时能看到特异的婴则需照
Rl 2uL和
维分子质最作室
U和5，总体积为25μ
免第 A.
章）25mmoL/l.的氯化
μL、Taq 5
董，加水到总体积为
年上层。在
，然后72
广增仪中，先94℃
8in,最后4℃保温。
g/mI.EB，第.9章)平板。将平
2uL.样品冲（见第A10章）混
使用puc
DVA/MspI(Hpa ll).
无DNA蔓并判定结果。
物做模板：如果PCR后的产物在电，取做模板
然后依加入以餐
Fa酶5,dNTP2μ,物R22.5μ和号IF22.5μ,10倍用浓缩的 Taq 酵缓冲液 10 μL冕
L/L的氛化镁10μL，加水到总体100每管加入50 μ矿物的闻低速离心让矿物油集中就上层将反应管置于PCR扩增仪。
1 min--giCmin 1 min,2次循环，然后 72 ℃ 8 min,最后先 94 ℃预变性4 min,再 94 起1℃保温。
6.9设立对照
6.9.1在6.1的样品处理过程中应设立阳性对照阳性对照和空白对照。6.9.2瑕含有已知IIINV参考株的细胞悬液为模板作阳性对照。6.9.3取正常的阴性组织为模板作阴性对照。6.9.4取等体积的水代替样品为模板作空白对照。7结果判定
经第一次PCR后阳性对照会出现一条了86bp的DNA带。阴性对照和空自对照没有该核酸带。套式PCR后阳性对照会出现-~条323bp的DNA带。阴性对照和空白对照均没有该核酸带。待测样酪PCR扩增后能在相应786hpTINA位置上有带.并具套式PCR扩增后能在相应323bpGB/T15805.22008
位置上有带或者虽经PCR扩增后可能因浓度太低看不到可见的DNA.带，似套式PCR扩增后能在相应323bp位置上有带者，均可判为阳性。无带的判为性。仅在PCR扩增有786bp的DNA带，但套式.PCR重复两次仍不能扩增出323bp的DNA带的样品也判为阴性。如果扩增山的1NA带的大小不是78Gbp与323bp应判为防性。如果带的大小和阳性片段接近难以确定，则需要谢序，板据是否和已知INA片段(参见附录B)的序列吻合来判定。Tr kAoNi kAca=
附录A
(规范性附录）
试剂配制
标谁中所有试剂，除特别注明外，全部采用分析纯的试剂。A.1细胞培养液
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TC199培养基，按说明书的要求配制。然后加人10%的胎牛血清，抽滤除菌，一20℃保存。A.2 CTAB溶液
按CTAB(hexadccyl trirnethyarnmoniumbroide)2%,氯化钠1.4moL/L,EDA20mmoL/L,Tris-HCl 20 mmoL/L pH=7. 5配制，用前加巯基乙醇至终淤度为 0.25%。A.3抽提液2
1moL/1.Tris水溶液饱和的酚：三氯中烷：异戊醇=25：24：1混合，密闭避光保存。A. 4抽提液 1
将三氛甲烷：异戊醉按24：1的比例混合，密闭避光保程。A.5逆转录酶A.MV的5倍浓缩缓冲液Tris-HCl
氯化钾(KCI)
氯化镁（MgCl）
250 rmmaL/L,pH 8. 3
250 mmoL/L
50 mrnoL/L
50 mmol/L
A.6氯化镁(MgC）溶液
浓度为 25 moL/。
A.7Tal酶用10倍浓缩缓冲液
Tris-HCl
氯化钾（KCI)
Triton X-100
500 mmoL/L.pH 8.8bzxz.net
500 mtnoL/L
A.8TBE电泳缓冲液（5倍浓缩液）Tris
硼酸(HBO:）
1000mL
用 moL/L的盐酸(HCI)调到pH 8. 0。A.9EB(ethidiumbromide，核酸染色剂）用水配制成10mg/ml的浓缩液。用时每I0mL电泳液或琼脂中加t1μL，A.10样品缓冲液
每100ml水溶液中含：漠酚蓝0.25，蔗糖10。5
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附录B
（资料性附录）
JHN 病毒N基的全序列(1 176bp)cactcagaga gacgttcact ggactcagagatgacaagcg
caggatccag agacggagia lcglcccagt acgataaccc trcctctalllacagarttag
agaaaggcat
ggtacggtcg
gcaccaccug
gaaaatgtcc
gatgtggaca
gtgcttagac:
tcrgacccag
ggaatgacaa
gaccttttag
ctgatgagga
aggatgctcg
tgcattetca
ataaaggtct
aagtacgatg
atggcatet
tccegtgagc
tttetecaag
gaieaugcgg gcggtgagte
acctagagat
aagtcggage
tgagcctcct
ccgaacttrt
gtgcgcgttgtcatigcag
gguagccetg ggtttegtgr
cgctacc
icaagc
ttgaggtig1
agatggccac
agttggtraa
ceggacagaa
ccatcgctgc
tggtgget
gaccggcctcctettcacct
afactgccea aacaagctcg
atcggaggca
agacggtccc
tggagtcttt
ttgcagaaac
gcgccctact
agcgtcttgc
aacaggggag tcctggccaa
rttcaacgcc
gctatetatg
gctcaccaag
cagaE
ggatcattet
ccatgagact
acctgggcgc
gttcaaccaa
gcegraaaga
catgaagtca gtggtggagt
aggaleigtg
tcgtagcaga
ggccccag
ccgccagacg
ggguggggta cttcaaggce tecgggatratgaacatcaa
ccgaccettt
gcgatggeic
ggggaccaga
caggagactc
注：涂型和划线处是引物序列。ggacactgon
gatcgtaaag
gartaagtal
aaccagccaa
gatcgggRcg
catcaacctg
gagcgngaca
ccttccegcc
cattgtcaga
catgatgagc
caggatcacc
acgegaacgc
rgataggtal gacgatgyga cctegagaggactgacaggg
caggaagctg gcgagggaga trgcicgic.uatceggagag ggggcgtcag agctgarccgecttgtcctc
ccggcggag
cetgggtgag gaegaggagg ggacgaggaggacgacgaccgactcatt
caciga
TTKAONTKAca-
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