GB/T 18654.13-2008
基本信息
标准号： GB/T 18654.13-2008
中文名称：养殖鱼类种质检验 第13部分：同工酶电泳分析
标准类别：国家标准(GB)
标准状态：现行
发布日期：2008-06-27
实施日期：2008-10-01
出版语种：简体中文
下载格式：.rar.pdf
下载大小：377760
标准分类号
标准ICS号：农业>>65.150捕捞和水产养殖
中标分类号：农业、林业>>水产、渔业>>B50水产、渔业综合
关联标准
出版信息
出版社：中国标准出版社
页数：12页
标准价格：14.0 元
计划单号：20079700-T-326
出版日期：2008-10-01
相关单位信息
首发日期：2008-06-27
起草人：李思发、赵金良、徐忠法、蔡完其、邹曙明
起草单位：上海水产大学、中国水产科学研究院长江水产研究院
归口单位：全国水产标准化技术委员会
提出单位：中华人民共和国农业部
发布部门：中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会
主管部门：农业部
标准简介
GB/T 18654的本部分规定了鱼类同工酶聚丙烯酰胺凝胶水平电泳分析的试剂与材料、仪器和设备、抽样、分析步骤和结果判定。本部分适用于鱼类同工酶电泳分析。 GB/T 18654.13-2008 养殖鱼类种质检验 第13部分：同工酶电泳分析 GB/T18654.13-2008 标准下载解压密码：www.bzxz.net
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标准内容
ICS65.150
中华人民共和国国家标准
GB/T 18654.13—2008
养殖鱼类种质检验
第13部分：同工酶电泳分析
Inspection of germplasm for cmltured fishes-Part 13 : Analysis of isozyme electrophoresis2008-06-27发布
2008-10-01实施
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局奇·发布
中国国家标淮花管理委赏会
GB/T18651养殖鱼类种质检验\分为下列部分：第1部分：检验规则；
第2部分：抽样方法
-第3部分：性状测定；
第 4 部分;年龄与生长的测定！第5部分：食性分析;
第6部分：繁殖性能的测定：
第7部分：生态特性分析；
第8部分，耗氧率与临界室息点的测定：第9部分：含肉率测定；
第10部行：凯因营养成分的谢定·第11部分：肌肉中主要氨基酸含量的测定;第12部分：染色体组型分析；
第13部分：同工酶电泳分析；
第14部分：DNA含量的测定：
第15部分：RAPD分析；
本部分为GB/T 18654的第13部分。本部分的附录A为规范性附录。
本部分山中华人民共和国农业部提出。本部分由全国水产标准化技术委员会揽水养殖分技术委员会归口。本部分起草单位：上海水产大学，中国永产科学研究院长江水产研究所本部分主要起草人：李思发、赵金良、徐忠法、蔡完其、邹明。GB/T 18654.13-2008
1范围
养殖鱼类种质检验
第13部分：同工酶电泳分析
GB/T 18654.13—2008
GB/T18654的本部分规定了鱼类同工酶骤丙烯酰胺凝胶水平电泳分析的试剂与材料、仪器和设备、抽样,分析步骤和结果判定。本部分适用于鱼类向工酶电泳分析。2 规范性引用文件
下列文件中的条款通过 GB/T 18654 的本部分的引用而戒为本部分的条款。凡是注且期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些受件的最新版本。凡是不注后期的引用文件，其最新版本适用于本部分。
GB/T18654.12002：养殖鱼类种质检验：第1分：检验规GB/T18654,2养殖鱼类种质榆验第2部分：抽样方法3原理
同工酶为该酶基因产物的表现型，根据其所带电荷的不同和分了大小、形状的不同，在电场和避胶中出现各同工酶组分不同的迁移率；经催化、染色扫描，根据酶带迁移距离，数目及吸收强度进行分析比较,判定鱼类物种,种群的遮传特性。4
试剂和材料
除非另有说明,在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离4. 1两烯酰胺(Arc)。
4.2N\,N\-亚甲基双丙烯酰胺或甲义双丙烯酰胺(Bis）4.3
阳甲基乙二胺(TEMED)
过硫酸胺。
三羟甲基氨基甲烷(Tris)。
4.6柠檬酸.
Z二胺四乙酸(EDTA)
4.8、硼酸。
4.9 L-组氨酸。
4.10乳酸。
4. 11 DL-苹果酸。
4. 12 α-磷酸甘油钠。
4. 13磷氢二钠(Na2HFO,)。
二个结晶水的磷酸二氢钠(NaHPO,2H,0)。4.15辅酶I(NAD)。
辅酶II(NADP)。
水战相当纯薄的水
GB/T 18654.13—2008
盼嗪甲酪硫酸盐（PMS)
氣化硝基四氮唑蓝(NBT)。
山梨醇。
DL-异柠檬酸兰钠。
6-磷酸葡葡糖双销。
α乙酸萘酯。
8-乙酸酯。
丙酮。
坚牢蓝RR盐。
氨基黑 10B。
95%乙醇。
盐酸(HICI)。
氧氧化钠(NaOH)店
固定液：3份乙醉
TC制胶缓冲视
EBT制胶缓滑
定容至 1 I
郭基氨
羟甲基
HC制胶缓冲液，氧氨酸1.9起
TC电极缓新
三羟甲基氨
EBT电极带
释至 15 L.
冲液：三羟围
HC电极制腰缓酐液：组氨酸
释至 10 L。
Arc.Bis 液：
4.3825%TEMEI
100 mg/mL
镜颜度：过硫
4.401%聚丙烯酰胺
TEMED 0.3 mL.10%过
改在保湿盒内备用。
蒙酸 21.014月
中烷65.4、EDTAwwW.bzxz.Net
双丙烯
按缓市
涯合离勺，
H8.0，燕馅永定至1L。
g,用调说至 pH8.6,蒸馅水
aOH调至H8.，蒸馏水定容至
8.0，蒸馅水稀释至10L。
g，用硼酸调至p8.6，蒸馏水稀
NaOI调pH8.5，蒸馏水稀
增水溶解辨定馨到500mL
蒸馅水37.5ml.、25%
0.6mL，混勾后，立即灌注到凝胶模具中集合感应结束后，取出避胶，4.411.5mol/LTris-HCl(8羟中基氮基甲烷181.71g痛HCL漏至pH8.0,蒸馏水稀释至1L.
21.5mol/LTris-HCl(pII9.5%羟甲基氮基甲烷181.71多HCl调至pH9.5，蒸馏水稀释率4.42
4.430.1mol/L磷酸缓冲液：NaHPO,·2H.01.6g.NaHPO14.2g，蒸馏水溶解并定容至1L。4.44
染色液：儿种常见同工酶染色液的配制方法见附录A。5仪器与设备
5.1微量匀浆机：转速4000r/min。5.2高速玲冻离心机：转速15000+/min以上，冷冻温度为4℃。5.3多用电仪。
5.4激光扫描仪。
5.5H计读数值0.01。
5.6微量加样注射器。
制胺模其
5.8染色红。
5.9低温冰箱:冰室温度在—
30以下，
5.10恒温暗养箱，
5. 11分析天平:感盒为 0.000 1 g5.12电子天平：感量为0.1g。
5.13照相机。
6抽样
6.1活体样品鱼的抽样
按GB/T 18654.2的
6.2取样
活体解韵样品鱼
样品鱼数量为 30尾以上。
于血液试样用注射塞从色的居动，7
分析步骤
7.1分析样品前制备
取0.3g样01份试样
2 min,粉碎组纤
液澄清，以上操
制备后样
7. 2凝胶制备
锻管将匀浆
主4℃低温
环销中暂存或
凝胶制备按式剂钮材料中4
7. 3 电泳步骤
7. 3. 1每次实验餐
7.3.2预电泳：依
感虹开多用
类不同
却板上，在50mA 电
7.3.3前电泳：预电泳
下;电泳 10 mimr。
执行。
GB/T 18654.13—2008
2试群，放是编的小塑料袭中，对低温冰箱中保存备用
于匀浆机中以4000/min浆
机中以15 0 r/nin离心直至上清预先制替的病烯胺凝胶放在玲
，用微最加样器在凝胶的点样糖中加人L的析样品，在25 tmA电流7.3.4正式电泳：在适当的电感再压电泳，电泳时间依海的种续面定7.4染色、脱色和固定
7.4.1染色：将电泳胶放人颜先配制并在37℃恒温箱中保温所需检測酶的染色液中染色。当酶带全部显示清断时,停山染色。
7. 4.2脱色:在2.5% 冰乙酸中脱色至凝胶背景晰、透明。7. 4. 3 固定:脱色后的电泳胶放入乙醇-冰乙酸-甘油-水的混合被中,其泥合比例为 3 1 1 ：1 5,固定数小时。
7.5制干胶片
取与凝胶板大小适中的玻璃纸，浸泡湿润后，平铺在凝胶板上，排空气泡，四周向下包紧。在室温下自然风下，制成透明胶片，编号保存。7.6摄影、扫描
用近镜头对凝胶及其谱带照相，用激光扫描仪对电泳谱带进行打描，计算同工酶各组分的相对含量。
GB/T18654.13—2008
7.7结果分析
7.7.1酶位点与等位基因分析：根据酶的结构组成和同工酶在组织中所表现的酶谱特征，确定种同工酶的缩码基因位点、多态位点的等位基因频率。7.7.2群体遗传异质性用多态座位比例(P)和平均杂合度(H)来度量，分别按式(1)和式(2)比算：P=
式中：
多态座位比例，%；
多态座位数；
所测基因总康位数;
I—合度；
等位基因的频率。
8结果判定
8.1个体测定结果的判定
n×100
H=2(1-2X)/n
按GB/T18654.1--2002中6.1的规定执行，.（12
将所有测定结果逐与标准对照，凡符合标准规定的判定为合格，凡不符合标准或与标准规定有显著差异的判定为不合格。
8.2样品群体的判定
根据8.1的判定结果，计算山被检样品中合格品的百分率，用%表示。工酶
醇脱氢酶
甘油-3-磷酸脱氨酶
α-GPDH
山梨醇脱氧醇
异柠檬酸脱氢酵
乳酸脱氨酶
华果酸脱氢酶
苹果酸酶
6·磷酸葡药糖脱氢酶
6-PGDH
超氧物歧化酶
附录A
（规范性黯录）
几种常现同工酶的染色配制方法表 A.1几种常见同工酶的染色配制方法辅酶1
染色缓冲液
0. 25 11ol/L Trib-HCl
PH8.0.140m
0. 1 mol/L 磷酸缓冲
液;150mL
0, 25 rnl/L Tris-HC1
PH9.5,114 mL
0, 25 nol/L Tri-HCl
pII8. 0.140 mL
1. 5 mol/L Tris-HCl
pH9.5.15 rT.
1. 5 mol/l. 'Tris-HCl
pH9. 5,15 mL
1. 5 mo1/L Tris-HCl
pH0.5,15 mL
1.5 mol/L Tris -HCI
pF8, 0.15 ml
0. 25 mol/L Tris-HCI
pH8. 0+140 mL
0. 5 mpl/L Trir-HCl
pH9. 5,118 mL
[1ng/mL
GB/T 18654.13--2008
其他试剂
95死乙醇 4. 5 mL
z-乙酸素酯20mg
P 乙酸萘酯 20 mg
丙酯 1 mL
坚率蓝双R100mg
1 mol/L. 甘油磷酸钠
山醇3g
异柠檬酸钠 400 mg
MgCl150mg
蒸馏水1051
1 mol/L乳酸 10 ml,
蒸罐水95mL
1mol/L苹果酸钠15mL
蒸缩水 90 ml
1 tul/L 果酸钠 15 mL
蒸馅水90n
6-磷酸葡萄糖酸钠75mg
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中华人民共和国国家标准
GB/T 18654.13—2008
养殖鱼类种质检验
第13部分：同工酶电泳分析
Inspection of germplasm for cmltured fishes-Part 13 : Analysis of isozyme electrophoresis2008-06-27发布
2008-10-01实施
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局奇·发布
中国国家标淮花管理委赏会
GB/T18651养殖鱼类种质检验\分为下列部分：第1部分：检验规则；
第2部分：抽样方法
-第3部分：性状测定；
第 4 部分;年龄与生长的测定！第5部分：食性分析;
第6部分：繁殖性能的测定：
第7部分：生态特性分析；
第8部分，耗氧率与临界室息点的测定：第9部分：含肉率测定；
第10部行：凯因营养成分的谢定·第11部分：肌肉中主要氨基酸含量的测定;第12部分：染色体组型分析；
第13部分：同工酶电泳分析；
第14部分：DNA含量的测定：
第15部分：RAPD分析；
本部分为GB/T 18654的第13部分。本部分的附录A为规范性附录。
本部分山中华人民共和国农业部提出。本部分由全国水产标准化技术委员会揽水养殖分技术委员会归口。本部分起草单位：上海水产大学，中国永产科学研究院长江水产研究所本部分主要起草人：李思发、赵金良、徐忠法、蔡完其、邹明。GB/T 18654.13-2008
1范围
养殖鱼类种质检验
第13部分：同工酶电泳分析
GB/T 18654.13—2008
GB/T18654的本部分规定了鱼类同工酶骤丙烯酰胺凝胶水平电泳分析的试剂与材料、仪器和设备、抽样,分析步骤和结果判定。本部分适用于鱼类向工酶电泳分析。2 规范性引用文件
下列文件中的条款通过 GB/T 18654 的本部分的引用而戒为本部分的条款。凡是注且期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些受件的最新版本。凡是不注后期的引用文件，其最新版本适用于本部分。
GB/T18654.12002：养殖鱼类种质检验：第1分：检验规GB/T18654,2养殖鱼类种质榆验第2部分：抽样方法3原理
同工酶为该酶基因产物的表现型，根据其所带电荷的不同和分了大小、形状的不同，在电场和避胶中出现各同工酶组分不同的迁移率；经催化、染色扫描，根据酶带迁移距离，数目及吸收强度进行分析比较,判定鱼类物种,种群的遮传特性。4
试剂和材料
除非另有说明,在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离4. 1两烯酰胺(Arc)。
4.2N\,N\-亚甲基双丙烯酰胺或甲义双丙烯酰胺(Bis）4.3
阳甲基乙二胺(TEMED)
过硫酸胺。
三羟甲基氨基甲烷(Tris)。
4.6柠檬酸.
Z二胺四乙酸(EDTA)
4.8、硼酸。
4.9 L-组氨酸。
4.10乳酸。
4. 11 DL-苹果酸。
4. 12 α-磷酸甘油钠。
4. 13磷氢二钠(Na2HFO,)。
二个结晶水的磷酸二氢钠(NaHPO,2H,0)。4.15辅酶I(NAD)。
辅酶II(NADP)。
水战相当纯薄的水
GB/T 18654.13—2008
盼嗪甲酪硫酸盐（PMS)
氣化硝基四氮唑蓝(NBT)。
山梨醇。
DL-异柠檬酸兰钠。
6-磷酸葡葡糖双销。
α乙酸萘酯。
8-乙酸酯。
丙酮。
坚牢蓝RR盐。
氨基黑 10B。
95%乙醇。
盐酸(HICI)。
氧氧化钠(NaOH)店
固定液：3份乙醉
TC制胶缓冲视
EBT制胶缓滑
定容至 1 I
郭基氨
羟甲基
HC制胶缓冲液，氧氨酸1.9起
TC电极缓新
三羟甲基氨
EBT电极带
释至 15 L.
冲液：三羟围
HC电极制腰缓酐液：组氨酸
释至 10 L。
Arc.Bis 液：
4.3825%TEMEI
100 mg/mL
镜颜度：过硫
4.401%聚丙烯酰胺
TEMED 0.3 mL.10%过
改在保湿盒内备用。
蒙酸 21.014月
中烷65.4、EDTAwwW.bzxz.Net
双丙烯
按缓市
涯合离勺，
H8.0，燕馅永定至1L。
g,用调说至 pH8.6,蒸馅水
aOH调至H8.，蒸馏水定容至
8.0，蒸馅水稀释至10L。
g，用硼酸调至p8.6，蒸馏水稀
NaOI调pH8.5，蒸馏水稀
增水溶解辨定馨到500mL
蒸馅水37.5ml.、25%
0.6mL，混勾后，立即灌注到凝胶模具中集合感应结束后，取出避胶，4.411.5mol/LTris-HCl(8羟中基氮基甲烷181.71g痛HCL漏至pH8.0,蒸馏水稀释至1L.
21.5mol/LTris-HCl(pII9.5%羟甲基氮基甲烷181.71多HCl调至pH9.5，蒸馏水稀释率4.42
4.430.1mol/L磷酸缓冲液：NaHPO,·2H.01.6g.NaHPO14.2g，蒸馏水溶解并定容至1L。4.44
染色液：儿种常见同工酶染色液的配制方法见附录A。5仪器与设备
5.1微量匀浆机：转速4000r/min。5.2高速玲冻离心机：转速15000+/min以上，冷冻温度为4℃。5.3多用电仪。
5.4激光扫描仪。
5.5H计读数值0.01。
5.6微量加样注射器。
制胺模其
5.8染色红。
5.9低温冰箱:冰室温度在—
30以下，
5.10恒温暗养箱，
5. 11分析天平:感盒为 0.000 1 g5.12电子天平：感量为0.1g。
5.13照相机。
6抽样
6.1活体样品鱼的抽样
按GB/T 18654.2的
6.2取样
活体解韵样品鱼
样品鱼数量为 30尾以上。
于血液试样用注射塞从色的居动，7
分析步骤
7.1分析样品前制备
取0.3g样01份试样
2 min,粉碎组纤
液澄清，以上操
制备后样
7. 2凝胶制备
锻管将匀浆
主4℃低温
环销中暂存或
凝胶制备按式剂钮材料中4
7. 3 电泳步骤
7. 3. 1每次实验餐
7.3.2预电泳：依
感虹开多用
类不同
却板上，在50mA 电
7.3.3前电泳：预电泳
下;电泳 10 mimr。
执行。
GB/T 18654.13—2008
2试群，放是编的小塑料袭中，对低温冰箱中保存备用
于匀浆机中以4000/min浆
机中以15 0 r/nin离心直至上清预先制替的病烯胺凝胶放在玲
，用微最加样器在凝胶的点样糖中加人L的析样品，在25 tmA电流7.3.4正式电泳：在适当的电感再压电泳，电泳时间依海的种续面定7.4染色、脱色和固定
7.4.1染色：将电泳胶放人颜先配制并在37℃恒温箱中保温所需检測酶的染色液中染色。当酶带全部显示清断时,停山染色。
7. 4.2脱色:在2.5% 冰乙酸中脱色至凝胶背景晰、透明。7. 4. 3 固定:脱色后的电泳胶放入乙醇-冰乙酸-甘油-水的混合被中,其泥合比例为 3 1 1 ：1 5,固定数小时。
7.5制干胶片
取与凝胶板大小适中的玻璃纸，浸泡湿润后，平铺在凝胶板上，排空气泡，四周向下包紧。在室温下自然风下，制成透明胶片，编号保存。7.6摄影、扫描
用近镜头对凝胶及其谱带照相，用激光扫描仪对电泳谱带进行打描，计算同工酶各组分的相对含量。
GB/T18654.13—2008
7.7结果分析
7.7.1酶位点与等位基因分析：根据酶的结构组成和同工酶在组织中所表现的酶谱特征，确定种同工酶的缩码基因位点、多态位点的等位基因频率。7.7.2群体遗传异质性用多态座位比例(P)和平均杂合度(H)来度量，分别按式(1)和式(2)比算：P=
式中：
多态座位比例，%；
多态座位数；
所测基因总康位数;
I—合度；
等位基因的频率。
8结果判定
8.1个体测定结果的判定
n×100
H=2(1-2X)/n
按GB/T18654.1--2002中6.1的规定执行，.（12
将所有测定结果逐与标准对照，凡符合标准规定的判定为合格，凡不符合标准或与标准规定有显著差异的判定为不合格。
8.2样品群体的判定
根据8.1的判定结果，计算山被检样品中合格品的百分率，用%表示。工酶
醇脱氢酶
甘油-3-磷酸脱氨酶
α-GPDH
山梨醇脱氧醇
异柠檬酸脱氢酵
乳酸脱氨酶
华果酸脱氢酶
苹果酸酶
6·磷酸葡药糖脱氢酶
6-PGDH
超氧物歧化酶
附录A
（规范性黯录）
几种常现同工酶的染色配制方法表 A.1几种常见同工酶的染色配制方法辅酶1
染色缓冲液
0. 25 11ol/L Trib-HCl
PH8.0.140m
0. 1 mol/L 磷酸缓冲
液;150mL
0, 25 rnl/L Tris-HC1
PH9.5,114 mL
0, 25 nol/L Tri-HCl
pII8. 0.140 mL
1. 5 mol/L Tris-HCl
pH9.5.15 rT.
1. 5 mol/l. 'Tris-HCl
pH9. 5,15 mL
1. 5 mo1/L Tris-HCl
pH0.5,15 mL
1.5 mol/L Tris -HCI
pF8, 0.15 ml
0. 25 mol/L Tris-HCI
pH8. 0+140 mL
0. 5 mpl/L Trir-HCl
pH9. 5,118 mL
[1ng/mL
GB/T 18654.13--2008
其他试剂
95死乙醇 4. 5 mL
z-乙酸素酯20mg
P 乙酸萘酯 20 mg
丙酯 1 mL
坚率蓝双R100mg
1 mol/L. 甘油磷酸钠
山醇3g
异柠檬酸钠 400 mg
MgCl150mg
蒸馏水1051
1 mol/L乳酸 10 ml,
蒸罐水95mL
1mol/L苹果酸钠15mL
蒸缩水 90 ml
1 tul/L 果酸钠 15 mL
蒸馅水90n
6-磷酸葡萄糖酸钠75mg
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