ＧＢ／Ｔ１７９９９的本部分规定了间接免疫荧光试验的技术要求等。本部分适用于对ＳＰＦ鸡进行鸡传染性贫血病毒(ＣｈｉｃｋｅｎＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＡｎａｅｍｉａＶｉｒｕｓ，ＣＩＡＶ)抗体的检测。 GB/T 17999.10-2008 SPF鸡 微生物学监测 第10部分：SPF鸡 间接免疫荧光试验 GB/T17999.10-2008 标准下载解压密码：www.bzxz.net

ICS11.220
中华人民共和国国家标准
GB/T 17999.10—2008
代替 GB/T 17999,9-1999
SPF鸡微生物学监测
第10部分：SPF鸡：间接免疫荧光试验: SPF chickenMierobiological surveillance-. Part 10: Indirect inmmunofluorcscent assay for SPF chicken2008-12-31发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2009-05-01实施
GB/T17999&SPF鸡”
微生物学监测》分为10个部分：第1部分：SPF鸡
-第 2 部分; SPF 鸡
第3部分：SPF鸡
微生物学监测总则；
红细胞凝集抑制试验：
迹清中和试验；
第4部分：SPF鸡
：血清平板凝集试验；
第5部分SPF鸡
第6部分:SPI鸡
第7部分：SPF鸡
第8部分:SPF鸡
第！部分：SPF鸡
第 10 部分:SPF鸡
琼脂扩敬试验；
酶联免疫吸附试验：
胚敏感减验；
鸡白沙门氏菌检验；
试管凝集试验：
间接免疫荧光试验，
本部分为GB/T17999的第10部分。本部分代替GB/T1799.9—1999&SPF鸡间接免疫炭光试验》。
本部分与GB/T17999.9—1999相比主要凌化如下：增加广规范性附录A“试剂的配制”和资料性附录13\细胞计数方法”，详细界定了试验成立条件和待检样品的判定标推。本部分的附录A为规范性附录。附录1为资料性附录。本部分由中华人民共和国农业部提出。GB/T 17999. 10—2008
：本部分用全国动物防疫标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。·本部分起草单位：小国农业科学院哈尔滨兽医谢究所、中国动物卫生与流行病学中心、济南斯帕法斯家育有限公司
本部分主要起草人：山连东、刘家森、韩凌霞、邵卫星、朱果、单忠芳、姜寒、司昌德、于海波、益庆文本部分所代替标推的历次版本发布情况为：GB/T 17999. 9—1999。
ht
1范围
SPF鸡：微生物学监测
GB/T17999.10—2008
第10部分:SPF鸡
间接免疫荧光试验
GB/T17999的本部分规定了间接免疫炭光试验的技术要求等本部分适用于对SPF鸡进行鸡传染性贫血病毒（ChickenInfectiousAnleiniaVirus，CIAVy抗体的检测。
前接免疫荧光试验，以病声感染细胞作抗原，与待检血清中的特异抗体结合，再与荧光色素标记的抗抗休结合，形成抗原一抗体一抗抗体复合物。光色素在紫外光或蓝紫光的作用下。激发出可见的炭光，因此山现荧光就说明标记物的存在，同时也反映了特异性抗体的存在。常来用已知抗原及荧光色素棕记的抗抗体检测相应的抗体。3试剂和器材
3.1试剂
3.1.1CIAV病毒DELROSE殊。
阴性、阳性血清。
被检血清：
3.1.4磷酸盐缓冲液(PBS)(附录A)。3.1.5异硫氙荧光素（FITC)标记抗鸡IgG（按说明稀释使用）冲甘池或封剂(见附录A)。
3.2·器材bZxz.net
抗原片。
凝盒。
37C培养箱。
荧光显微镜。
操作程序
4.1·感染细胞的制备
用含15%新生牛血清的DMEM培养基在39C和5%二氧化碳环境中培养MDCc-MSBI细胞。：细胞长至每毫汁5X10°个时（细胞计数参见附录B)，按种CIAV，并换成含5%新生牛血清的DMEM培养基，维续培养36h~~48h
4.2抗原片的制备
4.2. 1细胞病变(细胞体积增大2倍～3 倍)药达 50%~75%时，收集细胞培养物,以1500 r/min离心10 min，弃上清液，用FFS洗涤细胞沉淀物3次,并细胞计数,用PBS重悬细胞浓度。4.2.2取10μL细胞悬液（约含细胞105个），滴加于抗原片舒孔中，同时制备正带细胞对照片：4.2.3吹干滴好的抗原片，用4℃预冷的丙酮固定10min，保存于一20℃，一周内使用。btt
GB/T 17999.10—2008
4.3间接荧光抗体染色
4.3.1取山抗原片室温放置10min待用。4. 3. 2 用 PBS将被检血清、阴性血清、阳性血清分别稀释成 1 : 100,1 : 5C0 两个稀释度,分别取 10 μL滴加下抗原片名孔中，
4.3.3将加样抗原片置于湿盒内，37辩育30min。4. 3. 4角PBS浸洗 3 次,每次 10 min.4. 3.5 20 μI. FITC标记抗鸡 IgG滴加于上述处理过的抗原片各孔中,孵育,洗涤同前。4.3.6用缓油围油封片,置于荧光显微镜下观察5结果判定
试验成立条件
CIAV感染细胞制备亮尿,加入阳性血清，细胞核内可感溃晰的黄绿色爽光颗粒;加人阴性震细胞制备的抗原片中，加人阳性血清细胞核内无荧光颗粒。在以上血清，细胞核内无荧光赖凝
条件成立的基础工，进得街
5. 2 待检血清的判
给廉清判定
CTAV感染细胞器抗原片
阿性。
bt
肾晰的荧光颗意，待检血清判为2
缓冲甘油
附录A
（规范性附录）
试剂的配制
GB/T17999.10—2008
9份分析纯无荧光的甘油加1份0:2mol/L磁酸盐缓冲液（pH9.2）配制而成：0.2mol/L碳酸盐缓冲液
.0.17多碳酸钠（Na:C
3个月。
A.3PBS(0. 01 moIA
氧化钠
(KH.PO）.重
A: 4 DMEM(富
·的氢氧化钠或
的微孔滤膜赶
蒂养液
3. 7g碳酸
培养羧pI
4冰箱
酸氢钠（NaFQ）溶于
Q0mL.去离子水中，4C保存
12H0),0.2 磷酸二氢钾
离了水[,熟灿过搅拌。用 1 mol/L至1000m，尽快用孔径0.22μm
http:
GB/T 17999. 10—2008
附录B
【资料性附录】
细胞计数方法
B.1对细胞进行系列稀释，滴加到细跑计数板上，初步观察，若细驰密集，进一步稀释后，重新滴加到干净的细跑计数板上计数,
B.2细胞计数板在5×物镜下可见9个大方格，下10×物镜下计数位于4个角的大方格内的细胞数量(若细胞位大方格边线，仪计数位于上边线和左近线的细胞；并依据式(B.1)计算细胞浓度起始细胞浓度（个/mT.）=1.个大方格内细胞总和×稀静倍数×10*示例：
若1个大方格内的细胞总数为25个，细胞稀释度为1：10°，则：超确细胞浓度-25×10×10=G.25×10°（个/mL)）4
品秋伴网httn·
mrondme
-.-.-( R, 1
［1]NY/T 681—2003
鸡传染性贫血诊断技术
http：//foodmate.netGB/T 17999.10—2008
小提示：此标准内容仅展示完整标准里的部分截取内容，若需要完整标准请到上方自行免费下载完整标准文档。