本标准规定了水泡性口炎病毒荧光ＲＴ?ＰＣＲ 检测的操作方法。本标准适用于动物及其产品中水泡性口炎病毒的检测。 GB/T 22916-2008 水泡性口炎病毒荧光RT-PCR检测方法 GB/T22916-2008 标准下载解压密码：www.bzxz.net

ICS 11. 220
中华人民共和国国家标准
GB/T22916—2008
水泡性口炎病毒荧光RT-PCR检测方法Protocol of fluorogenic RT-PCR for vesicular 'stomatitis virus2008-12-31发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准花管理委员会
2009-05~01实施
GB/T22916—2008
本标准套考了迅界动物加生组织（()IE）《陆牛动物诊断试验和疫苗手册（哺乳动物，禽鸟与蜜蜂）》（第5版）
本标准的附录A为规范性附录附录B为资料性附录。本标出中华人民共和国农业部提出。木标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口：本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、中华人民共和国云南出人境检验检疫局。
本标准主要起草人：花群义、同晓黎、曾少灵、曹琛福、詹爱军、张彩虹、林庆燕、陈兵、杨云庆、孙洁范围
水泡性口炎病毒荧光RT-PCR检测方法本标准规定了水泡性口炭病毒荧光RT-PCR检测的操作方法本标准适用于动物及其产品中水泡性口炎病毒的检测2
缩略语bZxz.net
下列缩略语适用于本标准。
2. 1 : 荧光 RT-PCR
荧光反转录-聚合酶链反应。
每个反应管内的炎光信号达到设定的值时所经历的循环数。2.3RNA
核糖核酸。
然碳酸磷酯。：
磷酸盐缓冲盐水(配方见附录A)。2.6Tag酶
TagDNA聚合醇。
水泡性口炎病毒
GB/T 229162008
水泡性口炎病牵属RNA病毒；根据水泡性口炭病萨两避共有基因特定的序列，合成一对特异性引物和一条特异性的荧光双标记探针：通过严格设计和筛选的引物和探针，涵盖水泡性口炎病毒的两个型和突变株，为水泡性口炎病垂的特异性通用引物和探针探针的5端标记FAM荧光素，它发出的荧光能够被检测仪器接收，称为报告荧光基团：3端标记·TA.MRA荧光案，它在近距高内能吸收5'端报告荧光基团发山的荧光信号，称为萍灭荧光基团：在扩增时，Tag发摔它的5°-→3'端外切核酸酶的功能，将探针水解成单核哲酸，消除阻碍，标记在探针两端的报告荧光基团和率火荧光基团均游离于溶液中，仪器检测到发出的荧光信号。材料与试剂
攸器与器材
荧光RT-PCR检测仪。
高速台武冷冻离心机（离心速度12000+/min以上）。台式离心机（离心速度3000 1/min）。混勾器。
冰箱（2℃～8℃和—20℃两种）微量可调移液器5μ，10，100，1.000）及配套带滤芯吸头品伙伴网http：/
GB/1 22916—2008
4.1.7Eppendorf管(1.5tIl)、透明谢PCR管（0.2mL）4.2试剂
4.2.1除特别说明以外，本标推所用试剂均为分析继，所有试剂均用无RNA睡污染的容器（用DEPC水处理后高压灭菌)分装。
4.2.2三氯中烷
4.2.3异内醇：20%预冷。
4. 2. 4 PBS;配方死附录 A。
4. 2,575%乙醇:用新开启的无水乙利 DEPC水制，一20℃颈冷。4.2.6水池性口炎病薄荧光RT-PCR检测试剂盒：组成、势能吸使用注意事项鑫见附录B.4.2.7引物：上游引物为 5'ATCTCXTACAGITAAGAGAAECA-3',下游引物为 5'-TGAAGTAATCAGCCGGGTATTC-3
4.2.8荧光双标记探针（1
E):(FAM)S'-CGAAATIACEGGCCAACGAGGATC 3' (TAM能
AR)。扩增月标片段长度
5抽样
5. 1梁样工具
下梁样
棉拭予
剪刀、镊
注器，
5. 1.5 1.5 ml.
5.1.6研体。
5.2样品采集
整 121 ℃
ort管
5.2.1采集的样影主要是可腔、
即冷赢送检或放人意
黛素的PES
5.2.2水泡液及水
爱只有当水
不失时机电采集水池液器
精，然后用无南注射学
先用？
泡吸，
狗托皮缅、水
汇环境
、口蛇分源物利纽织。采集后立并作好请录，！
一日出赢很就会破资，所以要
掉污用硬桌生理影水擦去酒
液灭箱瓶博
以无菌术前下，放人合抗生索的IBS缓冲液中，若水泡已经破涉，则5.2.3水泡液来取后，
能求渠破渍的水泡皮，角求留与理盐水涮洗独水泡皮上的污物，放人更述级评液中。5.2. 4口腔分泌潮和咽喉属我示采取口腔分泌物或将拭了深人口腔肉来同刮 3 次一5 次取分泌微，找子-并放入盛有 1.0 1nl奢抗生素的品缓冲液的lm.Eppsor[管中。也可用食道探杯刮收咽喉液体，放人加有抗生素的PB等中。蕴号，冷藏送检或低温保藏。5.2.5m而液：用真空采血管或无菌注射幕查接采取至无点endar管中，率封、编号后保存于4℃环境中送检：
5.2.6肌肉或组织脏器：无菌采集待检样品，装入：次性塑料袋或其他菌容器，编号，冷藏送检或低温保藏。
5.3样品贮运
样品采集后，放入密闭的塑料袋内（--个采样点的样品，放人一个塑料裁内），于保温籍中加冰、密过，送实验室。
5.4样品制备
5.4.1水泡液、口腔分泌物、血液和精液样品在混勾器上充分混合后，用高压次菌镊子将拭了的液体挤出，室温放置30Tni，取上清液转2
Hklhttn·//Fnodmato
人无菌的1.5mLEppendarf管，编号备用。5.4.2水泡皮：肌肉或组织脏器
GB/T 22916--2008
取待检样品2.0g丁洁净、火菌齐烘干的研体中充分研磨，加10mLFIs混勾，4℃下以$000°r/min离心15min，取上清液转人无菌的1.5ml.Eppcndorr管中，编导备用。.5.5样本存放
制备的样本在2℃～8℃条行下保存应不超过24h，若需长期保存应置于-70℃以下，但应避免反复涨（冻融不超过三次）。
6操作方法
实验室要求
水池性口炎病睾荧光素TCR检测的实验室分为三个相减独立的作区域：样本制备区，反应混合物配制区和检测区：
应有明确标记，避免不同工作区购的设餐物品混用；征一区域应有专用的仪器设备；进
配制区至检测区
6.2样本的处理
作区域
6.2.1拆梓本制售食链行。样
6.2.2取n个
性对照、阴性对
6.2.3、每管加
个吸头，再加人
于颠倒混勾）
取与6
靓剂盒中己
高u裂解浴
L兰氟甲烧
C以12 000
同数量灭
吸取6.2.3各微：
混勾：
6.2.5于4℃
去上清液，侧置于暖
倒洗涤。
6. 2. 64 ℃,以 12
上清液转
,其中为
管中,上清
即只能从格本制备区、打扩增反应混合物化试测意出售可有行配制。
阳性对照与阴性射照的数量之和（旧性对照各0喜
份样本换用
于强烈，以最产严竭乳化层，也可以用异丙醇
-“C预冷），做标记。
最500，不靠吸出中间层，颠倒
持赖离慢机特触方向故置）小心倒游，如60075%之醇，题
n离心lo min(Eppcndorf管开口保技潮离心机转方向放置），小心倒去清没，倒骨吸水纸
量于液体（不同样品应在吸水纸不同地方干）。6.2.7以0001/min离心os(Eppendarr智开口保持期离心机转插方问放置）,将答壁上的余液体用到营底部，小心倒去上清液，服微量加样器将其吸十，一份样本换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀一面，室摄干燥3min，不能过于干燥，以兔RYA不溶6.2.8各管加入11LDFPC水，轻轻混匀：溶解管壁上的RNA，以2000r/mim离心5s，冰L保存备用。提瑕的RNA应在2h内进行PCR增；若需长期保存应放置丁-70℃冰箱内6.3检测
6.3.1扩增试剂准备
在反应混合物配制区进行。从试剂盒中取出相应的荧光RT-PCR反应液、Ta酶，在室温下融化后，以2000r/min离心5s。设所需荧光RT-PCR检测总数为n(n=u十2+T），其中为被检样品数、2为阳性对照数、1为阴性对照数；每个样品测试反应体系配制见表1。http：//fo
GB/1 22916—2008
表 1反应体系混合液的配制
每管最/T.
荧光RT-PCR反应液（2X）
RT-PCR反特录游颗粒
RNA酶抑制剂(RNa.sin）
ROX参考染料
(ROX relerece dye)
DEPC水
6, 3.2反应体系合液分装
1/2(颗）
管总用量/
价×1/2（颗）
根据测试样品的总数(π),计觉好各试剂的使用量，加人到运当体积的试管中，向其中加入n×1/2(颗)RT-PCR反转录酶题粒，充分混合均勾，间每个PCR管中各分装0μI.,转移至样本处理区。6.3.3加样
在样本处班区进行。在各设定的PCR管中分别加人6.2.8中制备的RNA滚液16L，盖紧管盖以500r/min离心30s。将PCR管放于96孔板，-定要按顺序记录好被检样品管、阳性对照管、阴性刘服管,转移至检测区。
6.3.4荧光RT-PCR检测
6. 3. 4. 1在检测区进行。将 6. 3. 2 中离心后的PCR管放人荧光 RT PCR 检测仪内,记录样本携放顺序，在9G孔板内（表内）记录或填写被检样品（LmkxOWn）、H性对照（PC)、阴性对照（NTC)。设置探针:5'为 FAM,3' 为 TAMAR.
6.3.4.2循环条件设量：
第阶段，反转录42℃/30min
第二阶段，预变性92℃/3min
第三阶段，92C/109，15℃/30$.72℃/门min，5个循环；第四阶段，92C/105，60\C/30s，10个循环，在第四阶段每个循环的退火延伸时收集炭光。试验检测结束后，根据收集的荧光谢綫和Ct值判定结果。7结果判定
7.1结果分析条件设定
直接取检测结果。基线和阅值设定原则根据仪器噪声情况行调整，以阅值线刚好超过正常阴性样品扩增山线的最高点为准。7.2质控标雅
7.2.1阴性对照无C值，并H无扩增曲线，一直为水平线，7.2.2阳性对照的Ct值应小于28.0，并出现典型的扩增曲线2个阳性对照扩增曲线基本重介，否则，此次实验视为无效。
7. 3结果描述及判定
7.3.1阴性
无Ct值片丑无扩增曲线，表示样品中尤水泡性口炎病毒。7.3.2阳性
Ct值小于等于30.0，凡出现典型的扩增曲线，表示样品中存在水泡性口炎病毒。7.3.3有效原则
Ct值在30.0~35.5的样木建议重做。重做结果无Ct值或大于35.0者为阴性，否则为阳性业mh+
(规范性附录）
试剂的配制
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0.2mo1/1.磷酸二氢钠水溶液：磷酸二氢钠(NaH2POH,O)27.6g，溶于蒸馏水中，最后稀释至1ocornl.
0.2mol/I.磷酸氢二钠水溶液：磷酸氢二钠（NazHPO.·7H,O)53.6g（或NazHPO,12H,O71.6g，或NaHPO。·2H,035.6g），班蒸馏水溶解，最后稀释至1000mL，A.30.01mOl/L、DH7.2磷酸盐缓冲盐水(PBS)的配制取A液1.41nL,B没36mL，氯化钠（NaCI)8.5g，用蒸馏水帮释牟1000mJ.经121℃15tnin高压炎菌，冷却后，无菌条件下按每离升加人10001U青霉素、1000以链露素。http://foodmate.netGB/T 22916--2008
B.试剂盒组成
(资料性附蒙）
试剂盒的组成
每个试剂盒可做48个检测，包括以下成分：裂解被
DEPC水
RT-PCR反应液(内含水池性口炎病毒的引物、探针）RT-PCR酶
阴性对照
阳性对照(非感染性体外转录RNA)ROX参考染将B.2说明
30mLXl盒
750 μL×1 管
2颗粒×12管
12μ×管
ImLxi管
2ml×1管
o. 1 mL×l 管
B.2. 1裂解液的主要成分为异硫氰酸胍和酚，为 RNA提取试剂,外观为红色液体,于 4 保存。B.2.2DEPC水是用 1头DEPC处后的去离了水用于溶解 RNAB.2.3RT-PCR反应液中含有特异性引物、探针及各种离子。R.3功能
试剂盒可用于动物组织粹品（包括水泡皮、水泡液、纠织、脏器、分泌物、血液等）中水泡性口炎病毒的检测。
,4使用时的注意事项
B4.1在测过程中,应严防不同样品间的交叉污染。B.4.2反应液分装时应避免产生气泡，上机前检查各反应管是否盖紧，以免荧光物质泄露污染仪器。B.4.3RT-PCR酶颗粒极易吸滤失活，应在室温条件下可门燥器内保存，使用时取出所需数量，剩部分立即放回干燥器中
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