本标准规定了蜂蜜中克伦特罗残留量液相色谱-串联质谱测定方法。本标准适用于蜂蜜中克伦特罗残留量的测定。 GB/T 22944-2008 蜂蜜中克伦特罗残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 GB/T22944-2008 标准下载解压密码：www.bzxz.net

ICS67.050
中华人民共和国国家标准
GB/T22944—2008
蜂蜜中克伦特罗残留量的测定
液相色谱-串联质谱法
Determination of clenbuterol residues in honey-LC-MS-MSmethod
2008-12-31发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2009-05-01实施
本标准的附录A、附录B为资料性附录。本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局本标准主要起草人：曹彦忠、石玉秋、贾光群、姚智慧、刘晓茂、庞国芳GB/T22944—2008bzxz.net
1范围
蜂蜜中克伦特罗残留量的测定
液相色谱-串联质谱法
本标准规定了蜂蜜中克伦特罗残留量液相色谱-串联质谱测定方法。本标准适用于蜂蜜中克伦特罗残留量的测定。本标准的方法检出限为1μg/kg。2规范性引用文件
GB/T22944—2008
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义(GB/T6379.1-2004,ISO5725-1:1994,IDT)GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法（GB/T6379.2—2004，ISO5725-2:1994，IDT）GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682--2008，ISO3696：1987，MOD）3原理
蜂蜜中残留的克伦特罗用乙酸钠缓冲溶液（pH=5.0）提取，过滤后，经OasisHLB\或相当的固相萃取柱净化，用氨水甲醇溶液洗脱并蒸干，残渣用甲醇-0.1%甲酸溶液溶解，过0.2μm滤膜后，样品溶液供液相色谱-串联质谱仪测定，内标法定量。4试剂和材料
4.1水：GB/T6682，—级。
4.2甲醇：色谱纯。
4.3乙：色谱纯。
4.4乙酸钠：优级纯。
4.5冰乙酸：优级纯。
4.6氨水：分析纯。
4.7甲酸：优级纯。
4.80.2mol/L乙酸钠缓冲溶液：称取16.4g乙酸钠（4.4），放人1000mL烧杯中，加人800mL水溶解，用冰乙酸（4.5）调至pH值为5.0，再用水定容至1000mL。4.9氨水-甲醇溶液（1十19）：吸取5mL氨水（4.6）与95mL甲醇（4.2)混合均匀。4.10甲醇溶液（3+7)：量取30mL甲醇与70mL水混合均匀。4.110.1%甲酸溶液：吸取1.0mL甲酸（4.7），用水稀释至1000mL。4.12甲醇-0.1%甲酸溶液（1+19）。量取5mL甲醇与95mL0.1%甲酸溶液（4.11)混合。4.13克伦特罗标准物质（CAS37148-27-9）：纯度≥95%。1）
OasisHLB固相萃取柱是Waters公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。1
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4.141.0mg/mL标准储备溶液：准确称取适量的克伦特罗标准物质（4.13），用甲醇配成1.0mg/mL的标准储备溶液。该溶液在4℃保存。4.151.0μg/mL标准工作溶液：吸取0.1mL标准储备溶液（4.14）放入100mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度。该溶液在4℃保存。
4.16内标物质：克伦特罗-D9，纯度≥99%。4.171.0mg/mL内标储备溶液：准确称取适量克伦特罗-D9标准物质（4.16），用甲醇配成1.0mg/mL内标贮备溶液。该溶液于4℃保存。4.181.0μg/mL内标工作溶液：吸取0.1mL内标储备溶液（4.17）放人100mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度。该溶液在4℃保存。
4.19基质标准工作溶液：吸取不同体积标准工作溶液（4.15）和20μL内标工作溶液（4.18），用空白样品提取液配成1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL、50.0ng/mL不同浓度的基质标准工作溶液。当天配制。
4.20OasisHLB固相萃取柱或相当者：500mg，6mL。用前依次用6mL甲醇和10mL水活化。保持柱体湿润。
4.21滤膜：0.2μm。
5仪器
5.1液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源。5.2固相萃取装置。
氮气浓缩仪。
液体混匀器。
分析天平：感量0.1mg，0.01g。5.6真空泵：最大负压80kPa。
pH计：测量精度士0.02。
5.8玻璃贮液器：50mL。
5.9吹干管：10mL。
6试样制备与保存
6.1试样的制备
对无结晶的实验室样品，将其搅拌均勾。对有结晶的样品，在密闭情况下，置于不超过60℃的水浴中温热，振荡，待样品全部融化后搅匀，冷却至室温。分出0.5kg作为试样。制备好的试样置于样品瓶中，密封，并做上标记。
6.2试样的保存
将试样于常温下保存。
7测定步骤
7.1提取
称取2g试样，精确至0.01g。置于150mL三角瓶中，加人20mL乙酸钠缓冲溶液（4.8），加入20μL内标工作溶液（4.18），于液体混勾器（5.4）上快速混匀1min，使试样完全溶解。7.2净化
将塞有玻璃棉的玻璃贮液器（5.8)连到OasisHLB或相当的固相萃取柱（4.20)上，把样液倒入玻璃贮液器中，调节流速小于3mL/min，使样液通过OasisHLB固相萃取柱，待样液完全流出后，依次用5mL水和5mL甲醇溶液（4.10）洗柱，弃去全部流出液。固相萃取柱减压抽干30min，然后用5mL氨2
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水-甲醇溶液（4.9)洗脱，收集洗脱液于10mL吹干管（5.9)中。在50°C水浴用氮气浓缩仪吹干。准确加人1.0mL甲醇-0.1%甲酸溶液（4.12)溶解残渣，过0.2μm滤膜后，供液相色谱-串联质谱仪测定。按上述操作步骤，制备用于配制系列基质标准工作溶液的空白样品提取液。7.3测定条件
7.3.1液相色谱参考条件
色谱柱：AtlantisCi8，3μm，150mmX2.1mm（内径）或相当者；a)
柱温：40°C；
流速；0.2mL；
进样量：20μL；
流动相：A：乙腈，B：0.1%甲酸水溶液，梯度洗脱条件见表1。表1梯度洗脱条件
时间/min
7.3.2质谱参考条件
离子源：电喷雾离子源；
扫描方式：正离子扫描；
检测方式：多反应监测；
电喷雾电压：5500V；
雾化气压力：0.083MPa；
气帘气压力：0.069MPa；
辅助气流速：6L/min；
离子源温度：500℃；
定性离子对、定量离子对、碰撞气能量和去簇电压见表2。表2定性离子对、定量离子对、碰撞气能量和去簇电压化合物中文名称
克伦特罗
化合物英文名称
clenbuterol
7.4液相色谱-串联质谱测定
7.4.1定性测定
定性离子对
277/203
277/259
定量离子对
277/203
碰撞气能量/
去簇电压/
被测组分选择1个母离子，2个以上子离子，在相同的试验条件下，样品中待测物质的保留时间与标准溶液中对应的保留时间偏差在士2.5%之内；且样品中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的标准溶液中对应的定性离子的相对丰度进行比较，若偏差不超过表3规定的范围，则可判定样品中存在对应的待测物。
表3定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度K
允许最大偏差
2010以%表示
K≤10
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7.4.2定量测定
在仪器的最佳工作条件下，用基质标准工作溶液（4.19)分别进样，以各标准溶液中被测组分峰面积与内标物峰面积的比值为纵坐标，以各标准溶液被测组分浓度与内标物浓度的比值为横坐标，绘制标准工作曲线。用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中克伦特罗的响应值均应在仪器测定的线性范围内。在上述色谱条件和质谱条件下，克伦特罗的参考保留时间为2.46min。克伦特罗的标准物质多反应监测(MRM)色谱图参见附录A中的图A.1。本方法中克伦特罗添加浓度及其平均回收率的试验数据参见附录B中的表B.1。7.5平行试验
按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。7.6空白试验
除不称取样品外，均按上述步骤进行。8结果计算
蜂蜜中克伦特罗残留量的测定结果按式（1)计算。1000
×A××A×m×1000
式中：
X—试样中被测物残留量，单位为微克每千克（μug/kg)；Cs
基质标准工作溶液中被测物的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL)；试样溶液中被测物的色谱峰面积；基质标准工作溶液中被测物的色谱蜂面积试样溶液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL)；基质标准工作溶液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL)；基质标准工作溶液中内标物的色谱峰面积；试样溶液中内标物的色谱峰面积；样液最终定容体积，单位为毫升（mL）；试样溶液所代表试样的质量，单位为克（g）。计算结果应扣除空白值。
9精密度
9.1一般规定
.（1)
本标准的精密度数据是按照GB/T6379.1和GB/T6379.2的规定确定的，其重复性和再现性的值是以95%的可信度来计算。
9.2重复性
在重复性试验条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限，蜂蜜中克伦特罗添加浓度范围及重复性方程见表4。表4添加浓度范围及重复性和再现性方程化合物名称
克伦特罗
添加浓度范围
注：m为两次测定值的算术平均值重复性限
单位为微克每千克
再现性限R
lgr=0.7801lgm-1.0478lgR=0.6655lgm-0.7535如果差值超过重复性限r，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。9.3再现性
在再现性试验条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R，蜂蜜中克伦特罗的添加浓度范围及再现性方程见表4。4
附录A
（资料性附录）
标准物质多反应监测（MRM)色谱图克伦特罗标准物质多反应监测（MRM)色谱图见图A.1。响6.0e41
值5.0c4+
1克伦特罗标准物质多反应监测（MRM)色谱图图A.1
附录B
（资料性附录）
回收率
本方法中克伦特罗添加浓度及其平均回收率的试验数据见表B.1。克伦特罗添加浓度及其平均回收率的试验数据表B.1
化合物名称
克伦特罗
添加浓度/(μg/kg)
GB/T22944—2008
平均回收率/%
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