本标准规定了蜂王浆及冻干粉中甲硝唑、地美硝唑、替硝唑、洛硝唑、特尼哒唑、异丙硝唑，以及羟基化甲硝唑、羟基化异丙硝唑、2-羟甲基-1-甲基化-5-硝咪唑等９种硝基咪唑类药物残留量的液相色谱?串联质谱测定方法。本标准适用于蜂产品(蜂王浆、冻干粉及蜂蜜)中硝基咪唑类药物残留量的测定。 GB/T 22949-2008 蜂王浆及冻干粉中硝基咪唑类药物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 GB/T22949-2008 标准下载解压密码：www.bzxz.net

ICS 67.050
中华人民共和国国家标准
GB/T 22949—2008
蜂王浆及冻干粉中硝基咪唑类药物残留量的测定
液相色谱-串联质谱法
Determination nitroimidazole residues in royal jellyand lyophilized royal jelly farina-LC-MS-MS method
2008-12-31发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2009-05-01实施
本标准的附录 A,附录 B为资料性附录。本标推由国家质量监督检验检疫总局提山并归口。GB/T22949—2008
本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局、中华人民共和国宁波出人境检验检疫局。
本标准主要起草人：殷居易、刘永明、谢东华、陈杰、李金、章再婷、范春林、裘定慧、庞国芳I
1范围
蜂宝浆及冻干粉中硝基咪唑类药物残留量的测定
液相色谱-串联质谱法
GB/T 22949—2008
本标雄规定了蜂王浆及冻干粉中甲硝唑、地美硝唑、替硝唑、洛硝唑、特尼哒唑、异丙硝唑，以及羟基化甲硝唑,羟基化异丙硝唑，2-羟甲基-1-甲基化-5-硝咪唑等9种硝基咪唑类药物残留量的液相色谱-串联质谱测方法。
本标准适用于蜂产品（蜂王浆、冻于粉及蜂蜜)中硝基咪唑类药物残留的测定。本标准蜂王浆样品的方法检出限：0.5g/kg。本标准冻干粉样品的方法检出限：1.0ug/kg。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过木标的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标谁达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用义件,其最新版本适用于本标推。GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义（GB/T6379.12004,ISO 5725-1.1994,IDT)
GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法(GB/T6379.2—2004,ISO5725-2:1994,IDT）GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682—2008,ISO3696:1987,MOD）3原理
本方法用乙酸纳缓冲液溶解样品基质，乙酸乙酯进行液-液萃取，经过旋转蒸干底，加人四氮化碳和含酸水溶液，离心后取上层溶液，运用液相色谱串联三重四极杆质谱仪(LC-MS-MS)进样检测。4试剂和材料
除另有说明外,所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。4.1乙腈：色谱纯。
4.2甲醇：色谱纯，
4.3艺酸艺：色谱纯。
4.4甲酸：色谱纯，
4.5四氯化碳。
4.6乙酸钠。
4.7标准品：甲硝唑（metronidazole，缩写MNZ;CAS：443-48-1），地美硝唑（dimetridazole，缩写DMZ;CAS:551-92-8),替硝唑(tindazole,缩写TNZ,CAS，19387-91-8),格硝唑(ronidazole,缩写RNZ;CAS:7681-76-7），特尼哒唑（ternidazole，缩写TerNDZ)，异丙硝唑（ipronidazole，缩写IPZ)，羟基化甲硝咪唑(retronidazole-OH,缩写MNZ-OH)，羟基化异丙硝唑(ipranidazolc-OH,缩写IPZ-OH),2-羟甲基-l-甲基化-5-硝咪唑（2-hydroxynethyl-1-methyl-5-nitro-imidazole，缩写HMMNI)，以上标雅物质纯度1
GB/T22949—2008
≥98%。内标物为氛代 2-羟甲基-1-甲基化-5-硝咪唑(HMMNI-D°;CAS：8061-52-7),氛代羟基化异丙硝唑(IPZ-0H-D,CAS：8061-52-7），氛代物质纯度≥95%4.8标准储备溶液;1000jg/ml。准确称取10.0mg士0.05mg各标准物质，用甲醇溶解于10mL棕色容量瓶中（可放置于超声波清洗器数分钟促进溶解），定容后配成浓度为1000g/mL的标准储备液。将储备液置于一20℃冰箱中保存备用。4.9标准中间溶液：100 ng/mL。可将标准储备溶液(4.8)室温下放置 5 min,使用时用乙腈稀释至所需浓度，临用临配。
4. 10乙酸钠缓冲溶液:0. 1 mai/L。确称取 8. 204 g无水乙酸钠,加人 5.83 mL 冰乙酸定容到1 000 mL容量瓶中超声混合并脱气15 min后，于液相色谱流动相瓶中备用。4. 11 甲酸水溶液:0. 1%。推确移取 1 mL 甲酸,用水定容到 1 000 mL 容量瓶中,超声混合并脱气 15 min后，于液相色谱流动相瓶中备用。4.12基质混合标准工作液：根据标物质的灵敏度和仪器线性范围，吸取一定量的中间浓度混合标准液（4.9),用空白样品提取液配制成系列浓度的基质混合标准工作液。临用临配。4.13滤膜：0.2μm。
5仪器
5.1液相色谱-申联三重四极杆质谱仪(LC-MS-MS)：质谱仪配有大气压化学电离源（或与之等效电离源）；高效液相色谱配有在线脱气机、低残留自动逊样器、可控温柱温箱和高精度混合泵。5.2电子分析天平：感量0.1mg和10mg。5.3冷冻离心机：速度可达4000r/min和13000r/min。5.4氮吹仪：水浴和加热控温。
5.5台式分散仪。
5.6旋转浓缩仪：带真空蒸发和循环冷却水。5.7超纯水器。
超声波清洗器。
多功能食品粉碎机。
旋渴混合仪。
5. 1l 鸡心瓶:125 mL。
5. 12离心管:15mL和50mL;四氟乙烯材质，5. 13容量瓶:10 mL 和 1 000 mL。6试样的制备与保存
6.1试样的制备
将波体、浆状，粉状的样品充分混合均匀；将低温保存的固体样品进行粉碎磨细后供检测。必要时将实验室样品用四分法进行缩分。报据样品的性状和保存要求将样品保存在适当的环境中避免变质。6.2试样的保存
将试样于一20 ℃球箱中保存备用。7测定步骤
称敢药 2. 5 g~5. 0 多 试样(蜂王浆称量 5. 0 ±0. 2 多;陈干粉称量 2. 5 ±0. 2 多)于 50 mL 离心管中,分别添加氛代标示物HMMNI-D、IPZ-OH-D\（4.7)100μL,加人20mL乙酸钠缓冲溶(4,10)充2
分祸旋振荡提取1min。
GB/T 22949--2008
再加入20mL乙酸乙酯，经过满旋、液-液萃取，将乙酸乙酯层全部移人鸡心旋蒸瓶，重复上述操作，合并三次乙酸乙酯提取液于鸡心旋蒸瓶，在40℃以下瘀缩近干，除去溶剂。7.2净化
鸡心旋蒸瓶残渣用1mL四氯化碳和1mL甲酸水溶液（4.11)溶解，充分涡旋1min。吸取上层水溶液，用微孔过滤膜(0.2 μm)过滤，此为试验溶液。7.3色谱测定
液相色谱参考条件
色谱柱：WatersSunfireODSCi:，5μm，250mmX4.6mm(内径)或相当者柱温：30：
流动相;0.1%甲酸水溶液;液相梯度见表 1:流速：800μL/min；
进样量：10μL。
表1液相色谱流动相梯度表
时间/min
质谱参考条件
流动相A(甲酸水溶液)/%
流动相B(乙腈溶液)/%
离子源：大气压化学电离源(或与之等效电离源)；b)
扫描方式：正离子扫描；
检测方式：多反应离子监测(MRM)；电喷雾电压(IS)：525竹V；
雾化气(NEB)相对开放流量：14.00mL/min；气帘气(CUR)相对开放流量：7.00mL/min；离子源温度（TEM)500℃
碰撞池出口电压(CXP):11 V;
选择离子驻留时间(Dwcll):50 tns;碰撞池人口电压(EP):10.0 V;
碰撞气(CAD)相对开放流量：8mL/min；辅助气流压力：413.8kPaz
去电压(DP)：35V；
焦环焦电压（FP）.200V：
喷雾器放电针电流(NC):2 μA;
流速/μL/min)）
检测器参数（正离子化模式），离子流转向电压（DF)：一200.0V：检测器脉冲信号增强电压p)
(CEM) :2 300. 0 Vi
定性离子对、定量离子对、碰撞气能量、色谱峰保留时间见表2。a
GB/T22949-2008
硝基咪唑类药物中英文名称，定性离子对，定量离子对、碰撞气能量、色谱峰保留时间化合物中文名称
羟基化甲硝味唑
甲硝唑
2-羟甲基-1-甲基
化-5-硝咪唑
氧代 2:羟甲基-1-甲基
化-5-硝咪哪
特尼哒唑
落硝唑
地美硝唑
替硝唑
羟基化异丙硝唑
代羟基化异丙硝唑
异丙硝唑
化合物英文名称
thetronidazule-OH
缩写:MNZ-0OH
metranidazole
缩写：MNZ
2-hydraxymethyl-1-methyl-
5-nitru-imidaznle
缩写:HMMNI
DP-2-Hydroxymethyl-i-
methyl-5-nitro-imidazole
缩写:HMMNI-D
ternidazole
缩写; TerNDz
raridazale
缩写：RN7
dimetridazole
缩写:DMZ
tindazole
缩写：TNZ
ipronidazole-OH
缩写:IPZ-OH
D-Ipronidazole-OH
缩写:IPZ-OH-D
ipronidazole
维写:IFZ
7.3.3液相色谱-串联三重四极杆质谱测定7.3.3.1定性测定
定性离子对
188.0/125, 9
188.0/144.0
172.0/128.0
172. 0/B2. 10
158,0/140,0
158.0/55.1
161.0/143.1
161.0/58.0
186.0/128.1
186,0/82.2
201.0/140.0
201.0/110.0
142.0/96.1
142.0/81.1
248.0/121.0
248.0/93.1
186.0/168,0
186.0/122.1
1890.0/171,0
189.0/125.0
170,0/124.1
170.0/109,1
定量离了对
188.0/125, 9
172.0/128.0
158.0/140.0
161.0/143. 1
186.0/128.1
201.0/140.0
142.0/06.1
248,0/121.0
186.0/168.0
189, 0/171. 0
170.0/124.1
碰撞气能盘
(CE)/V
色谱峰保留
时间/min
被测组分选择1个母离子，2个以1子离子,在相同试验条件下，样品中待测物保留时间与标准溶液中保留时间偏差在士2.5%之内；且样品中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的标准溶液中对应的定性离子的相对丰度进行比较，若偏差不超过表3规定的范国，则可判断为样品中存在对应的待测物。
表3定性确证时相对离子丰度的最大充许偏差相对离子丰度 K
允许的最大偏差
7.3.3.2定量测定
以%表亲
在仪器正常工作条件下，对基质混合标准工作溶液（4.12)进样，以标准溶液中被测组分峰面积为纵坐标，标准溶液中被测纽分浓度为横坐标绘制工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中4
GB/T 22949-2008
待测物的响应值均应在仪器测定的线性范围内，超过线性范围则应适当稀释后再进行分析。方法采用外标法定量，9种硝基账唑类药物和2种氛代内标物的多反应监测（MRM色谱图参见附录A图A.1。各分析物质的添加浓度及其平均回收率的试验数据参见附录B中表B.1和表B.2。7.4平行试验
按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。7.5回收率试验
阴性样品中添加标准溶液，按7.1和7.2 操作，测定后计算样品添加的回收率。8结果计算
蜂主浆及陈干粉中甲硝唑、地美硝唑、替硝唑、裕硝唑、特尼哒唑、异丙硝唑，改笈羟基化甲硝唑、羟基化异丙硝唑，2-羟甲基-1-中基化-5-硝咪唑等9种硝基咪唑类药物残留量的测定结果按式(1)计算：**××100
武中：
X=c.××%×≤*元
X——试样中被测物残留量,单位为微克每T克(ug/kg);G
-基质标准工作溶液中被測物的浓度，单位为纳克每亳升（ng/mI.)：试样溶液中被测物的色谱峰面积；A
基质标推工作溶液中被测物的色谱峰面积；A,
…试样溶液中内标物的浓度，单位纳克每毫升（ng/mL）-基质标推工作溶液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL)基质标推工作溶液中内标物的色谱峰面积；试样溶液中内标物的色谱峰面积；V
-样较最终定容体积，单位为升（mL)；m
试样溶滋所代表试样的质最，单位为克（g）。计算结果应扣除空白值。
9精密度
9.1一般规定
本标难的精密度数据是按照 GB/T 6379, 1 和 GB/T 6379. 2 的规定确定的，重复性和再现性的值以 95%的可信度来计算。
9.2重复性
在重复性试验条件下,获得的两次独立测试结果的绝对值不超过重复性限,被测物的添加浓度范围及重复性方程见表 4 和表 5。表4蜂王浆样品基质添加浓度范围及重复性和再现性方程呈单位为微克每于克
化合物名称
羟基化甲硝咪唑
甲硝唑此内容来自标准下载网
2-羟甲基-1-甲基化-5-硝咪唑
特尼啮唑
洛硝唑
地美硝唑
添加浓度范围
0.5~~25.0
0.5~25. 0
0.5~-25.0
0.5~-25.0
0.5~-25.0
0.5~-25.0
重复性限？
Igr=0. 957 0lgm-0.817 6
Igr=1. 092 21gm—0. 864 8
lgr=0.9930lgm—0.774 2
1gr=0, 906 71gm—0, 698 9
lgr=0. 981 41gm-0, 768 2
Igr=1,107 21gm—0, 860 6
再现性限R
lgR=0. 711 5lgm - 0. 582 9
lgR=0. 722 5lgm-0. 626 3
gR=0. 644 4lgm-0. 547 1
lgR=0. 661 91gm-0. 503 9
lgR=0. 600 11gm-0. 500 9
lgR=0,74251gm-0,5632
GB/T 22949--2008
化合物名称
替硝唑
羟基化异丙硝唑
异丙硝唑
加浓度范围
0. 5 ~ 25, 0
0. 5 ~25. 0
0. 5~~25. C
注：初为两次测定值的平均值。裘4（续）
复性限
lgr=0, 989 4gm-0. 761 6
1gr=0, 899 1lgm-0. 796 8
1gr=1.105 71gm—0.866 6
单位为微克每千克
再现性限R
IgR=0, 926 1lgm-0. 591 7
lgR=0. 480 5lgm-0. 497 8
1gR=0. 686 11gm—0, 566 8
表5冻干粉样品基质添加浓度范围及重复性和再现性方程化合物名称
羟基化甲硝咪唑
甲硝唑
2-羟甲基-1-甲基化-5-硝咪唑
特尼哒唑
地美硝唑
替硝唑
羟基化异丙硝唑
异丙硝唑
添加浓度范围
0. 5 ~ 25. 0
0. 5~25. 0
0. 5~25. 0
0. 5~25. 0
0.5~25. 0
0. 5 ~25. 0
0. 5 ~25. 0
注：切为两次测定值的平均值，重复性限
Igr=1. 242 6lgm-0, 956 4
lgr-- 0. 989 5lgm-0, 926 2
lgr=1. 087 7lgm—0. 987 3
1gr= 1. 027 6lgm—0. 814 9
1gr=0. 921 5lg#—0. 999 4
Igr=0. 874 2igm—0. 926 7
lgr=0.905 9lgm-0. 860 6
1gr- 0. 833 2lgm -0. 866 8
1gr=0. 464 2lgm-0. 812 6
单位为微克每千克
再现性限R
lgR=0. 764 2lgm-0, 594 0
lgR=0. 704 2lgm—0. 597 0
IgR=0.737 81gm-0.647 9
IgR=0. 669 81gm—0. 586 6
IgR=0.736 5lgm—0, 654 6
IgR=0. 404 2lgm—0. 580 5
IgR=0. 625 01gm-0, 609 7
IgR=0. 624 0lgm-0. 649 9
IgR-0. 160 5lg-0. 611 6
如果差值超过重复性限，应舍弃试验结果并重新完成两饮单个试验的测定。9.3再现性
在再现性试验条件下，获得的两次独立测试的结果的绝对差值不超过再现性限R，被测物的含量范围及再现性方程见表4和表5。
附录A
(资料性附录）
多反应监测(MRM)色谱图
9种硝基咪唑类药物和2种氛代内标物的多反应监测色谱图见图A.1。sa
5.28674.7.5
9.82,11.99
吋回／min
1. 3a.86 5. 43
30.213.58
吋间/mun
10, 92
f282 e. og ta. o2
时间/mr.in
9.4011.90
时ain
-羟基化甲硝咪唑；
2—甲硝唑；
-2-羟甲基-1-甲基化-5-硝咪唑;E
0.o33150525
11.4012-2513
时网min
时间/ni
822. 544.28 6.12 8.20糖
GB/T 22949—2008
C85.747.55
时间/wn
30.1114.23
时问min
ad5 3.8B 5 01 58 B. 09
时3/ain
特尼哒唑：
一裕硝唑；
7—·地美硝唑，
-氧代2-羟甲基-1-甲基化-5-硝咪唑8---替硝唑；
时回／mlh
-基化异丙硝唑；
-氛代羟基化异丙硝唑；
异丙硝唑。
围 A, 19 种硝基咪唑类药物和 2 种氛代内标物的多反应监测色谱图GB/T22949—2008
附录B
（资料性附录）
回收率
9种硝基咪唑类药物甲硝唑、地美硝唑、替硝唑、落硝唑、特尼哒唑、异丙硝唑、羟基化甲硝唑、羟基化异丙硝唑、2-羟甲基-1-甲基化-5-硝咪唑在蜂玉浆、冻于粉基质中的添加浓度及其平均回收率的实验室内试验数据,见表 B.1、表 B.2。表B.1蜂王浆样品基质中9种硝基咪唑类药物的添加浓度和平均回收率试验数据化合物名称
羟基化甲硝咪唑
甲硝唑
2-羟甲基-1-甲基化-5-硝咪唑
特尼哒唑
铬硝唑
地樊硝唑
替硝唑
羟基化异丙硝唑
异丙硝唑
添加液度/（1g/kg）
平均回收率/%
GB/T 22949—2008
表 B.2冻干粉样品基质中9种硝基咪唑类药物的添加浓度和平均回收率试验数据化合物名称
羟某化甲硝咪唑
甲硝噬
2-羟甲基-1-甲基化-5-硝咪唑
特尼哒唑
落硝唑
地美磷唑
替硝唑
基化异丙硝唑
异丙硝唑
添加浓度/(μg/kg)
平均回收率/%
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