本标准规定了河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中１２种β-兴奋剂残留量的液相色谱?串联质谱测定方法。本标准适用于河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中１２种β-兴奋剂多残留的测定。１２种β-兴奋剂药物包括溴布特罗、塞曼特罗、克仑特罗、克仑潘特、羟甲基氨克仑特罗、苯氧丙酚胺、马布特罗、莱克多巴胺、利托君、沙丁胺醇、特布他林和妥布特罗。 GB/T 22950-2008 河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中12种β-兴奋剂残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 GB/T22950-2008 标准下载解压密码：www.bzxz.net

ICS67.050
中华人民共和国国家标准
GB/T22950—2008
河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中12种β-兴奋剂残留量的测定
液相色谱-串联质谱法
Determination of 12 β-agonists residues in fugu,eel and baked eel-LC-MS-MSmethod
2008-12-31发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2009-05-01实施
本标准的附录A、附录B为资料性附录。本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归口。GB/T22950-—2008
本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局、中华人民共和国福建出入境检验检疫局、食品安全分析与检测技术教育部重点实验室（福州大学）。本标准主要起草人：杨方、刘正才、林永辉、李耀平、余孔捷、黄杰、陈健、陈国南、庞国芳。1
1范围
河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中12种β-兴奋剂残留量的测定
液相色谱-串联质谱法
GB/T22950—2008
本标准规定了河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中12种β-兴奋剂残留量的液相色谱-串联质谱测定方法。本标准适用于河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中12种β-兴奋剂多残留的测定。12种β-兴奋剂药物包括溴布特罗（brombuterol）、塞曼特罗（cimaterol）、克仑特罗（clenbuterol），克仑潘特（clenpenterol）、羟甲基氨克仑特罗（hydroxymethylclenbuterol）、苯氧丙酚胺（isoxsuprine）、马布特罗（mabuterol）、莱克多巴胺（ractopamin）、利托君（ritodrine）、沙丁胺醇（salbutarnol）、特布他林（terbutaline）和妥布特罗(tulobuterol)。
本标准中莱克多巴胺、沙丁胺醇、塞曼特罗、克仑潘特和克仑特罗的方法检出限为0.1μg/kg，漠布特罗、妥布特罗、马布特罗、特布他林、利托君、苯氧丙酚胺和羟甲基氨克仑特罗的方法检出限为0.5μg/kg。
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义(GB/T6379.1-2004,ISO5725-1:1994，IDT)GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法（GB/T6379.2-2004,ISO5725-2:1994IDT）GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682--2008，ISO3696：1987，MOD）3原理
样品经稀酸水解、高氯酸沉淀蛋白后，残留的β兴奋剂以乙酸乙酯与异丙醇混合浴剂萃取，混合型阳离子交换反相吸附固相萃取小柱净化，液相色谱-串联质谱进行测定，内标法定量。4试剂和材料
除非另有说明，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。4.1甲醇：色谱纯。
4.2异丙醇。
4.3乙酸乙酯。
4.4乙腈：色谱纯。
4.5甲酸。
4.6高氯酸。
4.7盐酸。
4.8氢氧化钠。
GB/T22950—2008
4.9乙酸铵：色谱纯。
氨水。
氯化钠。
10mol/L氢氧化钠溶液：称取40g氢氧化钠至100mL水中，混匀。0.1mol/L高氯酸溶液：移取0.4mL高氯酸至100mL水中，混匀。4.13
0.1mol/L盐酸溶液：移取0.85mL盐酸至100mL水中，混匀。4.155mmol/L乙酸铵溶液：称取0.385g乙酸铵至约800mL水中，加人2mL甲酸，定容至1000mL，混匀。
4.16甲醇-0.1%甲酸溶液：移取0.1mL甲酸于约50mL水中，加人10mL甲醇，以水定容100mL，混匀。
4.17标准物质：溴布特罗、塞曼特罗、克仑特罗、克仑潘特、羟甲基氨克仑特罗、苯氧丙酚胺、马布特罗、莱克多巴胺、利托君、沙丁胺醇、特布他林和要布特罗，纯度大于98.0%。4.18内标标准物质：盐酸克仑特罗-D9、盐酸莱克多巴胺-D5、沙丁胺醇-D3，纯度大于98.0%。4.19标准储备液（100μg/mL）：准确称取适量（精确到0.1mg）的溴布特罗、塞曼特罗、克仑特罗、克仑潘特、羟甲基氨克仑特罗、苯氧丙酚胺、马布特罗、莱克多巴胺、利托君、沙丁胺醇、特布他林和妥布特罗，用甲醇分别配制成100μg/mL的标准储备液，一20℃冰箱中保存。4.20混合标准储备液（1μg/mL）：分别准确量取1.0mL的标准储备液至100mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，一20℃冰箱中保存。4.21内标储备液（100μg/mL）：准确称取适量（精确到0.1mg）的克仑特罗-D9、莱克多巴胺-D5、沙丁胺醇-D3对照品，用甲醇配制成100μg/mL的标准储备液。4.22内标工作液（10ng/mL）：分别准确量取适量的同位素内标储备液至同一容量瓶中，用甲醇稀释定容成浓度为10ng/mL的同位素内标工作液，一20℃下冰箱中保存。4.23基质标准工作溶液：以空白基质溶液将混合标准储备液与内标工作液稀释至适当浓度，临用现配。
4.24混合型阳离子交换反相吸附固相萃取柱：60mg/3mL，使用前依次用3mL甲醇和3mL水活化，保持柱体湿润。
4.25滤膜：0.2μm。
5仪器和设备
5.1高效液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾电离（ESI)源。5.2天平：感量0.1mg和0.01g。
组织捣碎机。
高速冷冻离心机：转速可达15000/min，致冷可达4℃。5.4
离心机：4000r/min。
旋涡振荡器。
电热恒温振荡水槽。
3pH计。
旋转蒸发仪。
5.10固相萃取装置。
氮吹仪。
6试样制备和保存
6.1试样制备
河豚鱼、鳗鱼取连皮的鱼肉，将皮、肉分离后取鱼皮置于微波炉中加热后连同鱼肉、鳗鱼制品取所有2
可食部分一并放入组织捣碎机均质，充分混勾，装入清洁容器内，并标明标记。制样操作过程中应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。6.2试样保存
试样于一18℃以下保存，新鲜或冷冻的组织样品可在2℃～6℃贮存72h。7测定步骤
7.1提取
GB/T22950—2008
准确称取5g（精确到0.01g）测试样品于50mL聚丙烯离心管内，加人50μL10ng/mL的内标物，加入20mL0.1mol/L盐酸溶液（4.14），涡旋混匀，于37℃下避光水浴振荡16h（过夜），取出冷却至室温，加人5mL0.1mol/L高氯酸溶液（4.13），涡旋混匀，4℃下15000/min离心10min，分取10mL上清液转移至另一50mL离心管内。用10mol/L氢氧化钠溶液（4.12）调节pH值至9.7土0.3，加入约2g氯化钠后，再加25mL异丙醇-乙酸乙酯（3十2），涡动提取2min，4500r/min离心5min，取出上清液至另一50mL离心管中。再在下层水相中加15mL乙酸乙酯-异丙醇（7十3），涡动提取1min，4500r/min离心5min，合并有机相，40℃下旋转蒸发至近干，加入5mL0.1mol/L盐酸溶液（4.14），涡动1min，待净化。7.2净化
将7.1所得溶液以约1mL/min的流速全部过混合型阳离子交换反相吸附固相萃取柱（4.24），依次用3mL水、3mL2%甲酸水溶液和2mL甲醇淋洗，抽干，用5mL5%氨水甲醇溶液洗脱，洗脱液于40℃下以氮气吹至近干，以0.5mL甲醇-0.1%甲酸溶液（4.16）溶解，涡动混匀，过0.2μm滤膜（4.25），供液相色谱-串联质谱仪测定。7.3空白基质溶液的制备
称取阴性样品5g（精确至0.01g），按7.1和7.2步骤操作。7.4液相色谱-串联质谱测定
液相色谱条件
a）色谱柱：AcquityUPLCBEHCig，1.7μm，55mmX2.1mm（内径）或相当者；b)
流动相：A为5mmol/L乙酸铵溶液（4.15），B为0.1%甲酸乙，梯度洗脱，洗脱程序见表1；表1梯度洗脱程序
时间/min
流速：0.25mL/min；
d）柱温：30℃；
进样量：10μL。
7.4.2质谱条件
a）离子源：电喷雾源（ESI)，正离子模式；扫描方式：多反应监测（MRM）；b）
毛细管电压：1.5kV；
GB/T22950-2008
源温度：120℃；
去溶剂温度：450℃；
锥孔气流（氮气）：45L/h
去溶剂气流（氮气）：700L/h；磁撞气压（氩气）：2.20×10-5Pa；驻留时间：0.20s。
液相色谱-串联质谱测定
定性测定
每种被测组分选择1个母离子，2个以上子离子，在相同试验条件下，样品中待测物质的保留时间与混合基质标准校准溶液中对应浓度标准校准溶液的保留时间偏差在土2.5%之内；且样品谱图中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的混合基质标准校准溶液谱图中对应的定性离子的相对丰度进行比较，偏差不超过表2规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。表2定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度K
允许的相对偏差
7.4.3.2定量测定
2010以%表示
内标法定量：用混合标准工作溶液分别进样，以分析化合物和内标化合物的峰面积比为纵坐标，以分析化合物和内标化合物的浓度比为横坐标作标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，标准工作液和待测液中12种药物的响应值均应在仪器线性响应范围内。12种β-兴奋剂药物的保留时间、母离子和子离子见表3。12种β-兴奋剂药物的标准物质的多反应监测（MRM)色谱图参见附录A中的图A.1，添加浓度及其平均回收率的试验数据参见附录B中的表B.1。表312种β-兴奋剂类药物保留时间、定性定量离子对及锥孔电压、碰撞能量化合物名称
莱克多巴胺
沙丁胺醇
塞曼特罗
克仑潘特
克仑特罗
溴布特罗
妥布特罗
保留时间/
定性离子对
302/164
302/284
240/148
240/166
220/160
220/202
291/203
291/273
277/203
277/259
367/293
367/349
228/119
228/154
定量离子对
302/164
240/148
220/160
291/203
277/203
367/293
228/154
锥孔电压/
磁撞能量/
化合物名称
马布特罗
特布他林
利托君
苯氧丙酚胺
羟甲基氨克仑特罗
克仑特罗-D9
沙丁胺醇-D3
莱克多巴胺-D5
保留时间/
表3（续）
定性离子对
311/237
311/293
226/125
226/152
288/121
288/270
302/150
302/284
293/203
293/275
286/204
243/151
308/168
定量离子对
311/237
226/152
288/270
302/150
293/203
286/204
243/151
308/168
GB/T22950—2008
锥孔电压/
碰撞能量/
采用克仑特罗-D9定量的化合物有：克仑潘特、克仑特罗、溴布特罗、妥布特罗、马布特罗、苯氧丙酚胺。
采用沙丁胺醇-D5定量的化合物有：沙丁胺醇、塞曼特罗、特布他林。采用莱克多巴胺-D5定量的化合物有：莱克多巴胺、利托君、羟甲基氨克仑特罗。7.5平行试验
按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。8结果计算
试样中兴奋剂类药物残留量利用数据处理系统计算或按式（1）计算：V1000
式中：
试样中被测组分残留量，单位为微克每千克（μg/kg）；-从标准工作曲线得到的被测组分溶液浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；V-试样溶液定容体积，单位为毫升(mL)；m-
-试样溶液最终所代表试样的质量，单位为克(g)。计算结果应扣除空白值。
9精密度
9.1一般规定
...(1)
本标准的精密度数据是按照GB/T6379.1和GB/T6379.2的规定确定的，重复性和再现性的值以95%的可信度来计算。
9.2重复性
在重复性试验条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r，被测物的添加浓度范围及重复性方程见表4。
GB/T22950—2008
表412种β-兴奋剂类药物的含量范围及重复性和再现性方程单位为毫克每千克化合物名称
菜克多巴胺
沙丁胺醇
塞受特罗
克仑潘特
克仑特罗
溴布特罗
妥布特罗
马布特罗
特布他林
利托君
苯氧丙酚胺
羟甲基氮克仑特罗
添加浓度范围
重复性限T
lgr=1.2554lgm-0.8080
Ig r=1. 276 7 lgm-0. 494 6
Ig r=1.114 8 lg m-0. 780 4
Ig r=1. 079 7 lg m-0. 675 2
Ig r=1. 006 2 lg m-0. 769 7
lgr=1.0360lgm-0.5762
lgr=1.1378lgm-0.4915
lgr=0.9981lgm-0.6873
lgr=0.9798lgm-0.7052
lgr=0. 9654lgm-0. 712 9
lgr=1.1228lgm-0.8142
Ig r=1. 017 0 lgm-0. 718 2
再现性限R此内容来自标准下载网
lgR-1.0324lgm-0.4984
IgR=1.0380lgm-0.5013
lgR1.0153lgm0.5039
lgR=0.8926lgm-0.5742
IgR=0.9598lgm-0.497 4
IgR=1,0858lgm-0.5339
gR=0.9408lgm-0.5826
lgR=1.0205lgm-0.5182
lgR-1.0387lgm-0.4810
IgR=0.9735lgm-0.4816
IgR=0.9505lgm-0.5014
IgR=0.9794lgm--0.4680
如果差值超过重复性限，应舍弃奔试验结果并重新完成两次单个试验的测定。3再现性
在再现性试验条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R，被测物的添加浓度范围及再现性方程见表4。
附录A
（资料性附录）
标准物质的多反应监测（MRM)色谱图12种β-兴奋剂类药物标准物质的多反应监测（MRM)色谱图见图A.1。100
塞受特罗
特布他林
沙丁胺醇
沙丁胺醇-D3
妥布特罗
220.03/160.43
226.02/152.03
240.1/148.1
243.1/151.2
227.99/154.03
克仑特罗
克仑特罗-D9
克仑播特
277.1/203
286/204.4
290.6/203
利托君
GB/T22950—2008
288.03/121.04
羟甲基氨克仑特罗2
292.96/202.78
莱克多巴胺
莱克多巴胺-D5
苯氧丙酚胺
302.1/164.1
m1/min
308.1/168.4
ri/min
302.48/150.33
mmmpmmmpt/min
马布特罗
310.96/236.67
溴布特罗
366.77/292.65
mt/min
12种β-兴奋剂类药物标准物质的多反应监测（MRM）色谱图5.00
GB/T229502008
附录B
（资料性附录）
回收率
12种β-兴奋剂类药物的添加浓度及其回收率范围的试验数据见表B.1。表B.1
12种-兴奋剂类药物的添加浓度及其回收率范围的试验数据化合物名称
莱克多巴胺
沙丁胺醇
塞曼特罗
克仑潘特
克仑特罗
漠布特罗
妥布特罗
添加浓度/（μg/kg）
河豚鱼
平均回收率/%
化合物名称
马布特罗
特布他林
利托君
苯氧丙酚胺
羟甲基氨克仑特罗
添加浓度/（μg/kg）
表B.1（续）
河豚鱼
平均回收率/%
GB/T22950—2008
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