本标准规定了河豚鱼和鳗鱼中链霉素、双氢链霉素和卡那霉素残留量液相色谱-串联质谱测定方法。本标准适用于河豚鱼和鳗鱼中链霉素、双氢链霉素和卡那霉素残留量的测定。 GB/T 22954-2008 河豚鱼和鳗鱼中链霉素、双氢链霉素和卡那霉素残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 GB/T22954-2008 标准下载解压密码：www.bzxz.net

ICS67.050
中华人民共和国国家标准
GB/T22954-2008
河豚鱼和鳗鱼中链霉素、双氢链霉素和卡那霉素残留量的测定
液相色谱-串联质谱法
Determination of streptomycin,dihydrostreptomycin andkanamycin residues in fugu and eelLC-MS-MSmethod
2008-12-31发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2009-05-01实施
本标准的附录A、附录B为资料性附录。本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局。本标准主要起草人：刘晓茂、张守军、张进杰、曹彦忠、杨志伟、曹亚平、庞国芳GB/T22954—2008
1范围
河豚鱼和鳗鱼中链霉素、双氢链霉素和卡那霉素残留量的测定
液相色谱-串联质谱法
GB/T22954—2008免费标准下载网bzxz
本标准规定了河豚鱼和鳗鱼中链霉素、双氢链霉素和卡那霉素残留量液相色谱-串联质谱测定方法。
本标准适用于河豚鱼和鳗鱼中链霉素、双氢链霉素和卡那霉素残留量的测定。本标准方法的检出限：链霉素、双氢链霉素和卡那霉素的检出限均为10.0μg/kg。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义(GB/T6379.1—2004,ISO5725-1:1994,IDT)GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法（GB/T6379.22004，ISO5725-2：1994，IDT）GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682—2008，ISO3696：1987，MOD）3原理
河豚鱼或鳗鱼试样中的抗生素用磷酸溶液提取，三氯乙酸沉淀蛋白，用苯磺酸型和羧酸型固相萃取柱净化。液相色谱-串联质谱仪(ESI+)检测，外标法定量。4试剂和材料
除另有说明外，所用试剂均为优级纯。4.1水：GB/T6682，级。
4.2甲醇：色谱纯。
4.3乙睛：色谱纯。
4.4甲酸。
4.5浓磷酸。
4.6磷酸氢二钾（K,HPO,）。
4.7三氯乙酸（CHClO2）。
4.8庚烷磺酸钠(C,HisNaO,S·HO)。4.95%磷酸溶液（1+19）：取50mL浓磷酸（4.5）,用水定容至1L。4.100.2mol/L磷酸盐缓冲溶液：pH=8.5。称取34.8g磷酸氢二钾（4.6)用水溶解，定容至1L，用氢氧化钠溶液调节pH=8.5。
4.11三氯乙酸溶液：50%，质量分数。取20g三氯乙酸（4.7），用水定容至20mL。4.120.01mol/L庚烷磺酸钠溶液：称取2.20g庚烷磺酸钠（4.8）,用水溶解，定容至1L。1
GB/T22954—2008
4.13SPE洗脱溶液：取4mL甲酸（4.4），用0.01mol/L庚烷磺酸钠溶液（4.12）定容至100mL4.1425%甲醇溶液（1+3）：取25mL甲醇（4.2），用水定容至100mL。4.15标准物质：链霉素（CAS：3810-74-0）、双氢链霉素（CAS:128-46-1)和卡那霉素（CAS:25389-94-0）；纯度均≥98%。
4.161.0mg/mL标准储备溶液：称取适量的链霉素、双氢链霉素和卡那霉素标准物质（4.15），分别用0.3%乙酸水溶液溶解并配制成1.0mg/mL的标准储备溶液。避光保存于一18℃冰柜中。4.170.1μg/mL混合标准溶液：吸取适量链霉素、双氢链霉素和卡那霉素标准储备溶液（4.16），用0.3%乙酸水稀释成0.1μg/mL的混合标准溶液，避光保存于一18℃冰柜中。4.18苯磺酸型固相萃取柱（500mg，3mL)或相当者。使用前依次用5mL甲醇和10mL水预处理，保持柱体湿润。
4.19羧酸型固相萃取柱（500mg，3mL或相当者。使用前依次用5mL甲醇和10mL水预处理，保持柱体湿润。
4.20滤膜：0.2μm。
5仪器
液相色谱-串联四极杆质谱仪，配有电喷雾离子源。5.2分析天平：感量0.1mg和0.01g。5.3液体混匀器。
固相萃取装置。
5.5均质器。
5.6真空泵：真空度应达到80kPa。5.7行
微量注射器：25μL，100μL。
5.8pH计：测量精度士0.02pH单位。5.9具塞离心管：100mL。
5.10刻度离心管：5mL。
5.11贮液器：50mL。
5.12离心机：转速4000r/min以上。6试样的制备与保存
6.1试样的制备
实验室样品混合均匀，分出0.5kg作为试样。6.2试样保存
试样置于-18℃冰柜，避光保存。7测定步骤
7.1待测样品溶液的制备
7.1.1样品提取和初净化
称取河豚鱼或鳗鱼样品10g（精确到0.01g），置于100mL离心管中，加入30mL5%磷酸溶液（4.9），均质3min，并用5%磷酸溶液清洗均质器刀头合并洗涤液，加人3mL三氯乙酸溶液（4.11）涡旋混合后在4000r/min下离心10min。上清液全部倒人下接苯磺酸型固相萃取柱（4.18）的贮液器中，在固相萃取装置上使样液以小于2mL/min的流速通过萃取柱，待样液全部通过固相萃取柱后，依次用5mL5%磷酸溶液（4.9）和10mL水洗涤苯磺酸型固相萃取柱（4.18），弃去全部流出液。用20mL磷酸盐缓冲溶液（4.10）洗脱至50mL离心管中。2
7.1.2样品溶液再净化
GB/T22954—2008
上述洗脱液倒入下接羧酸型固相萃取柱（4.19）的贮液器中，在固相萃取装置上使样液以小于2mL/min的流速通过萃取柱，待样液全部通过固相萃取柱后，依次用10mL水和10mL25%甲醇溶液(4.14)洗涤羧酸型固相萃取柱（4.19），弃去全部流出液。减压抽干羧酸型固相萃取柱（4.19)30min。用2mLSPE洗脱液（4.13)洗脱至5mL刻度离心管中，用SPE洗脱液（4.13）定容至2.0mL，混匀后过0.2μm滤膜（4.20），供液相色谱-串联质谱测定。7.2基质混合标准校准溶液的制备称取五个阴性河豚鱼或鳗鱼样品10g（精确到0.01g），分别置于100mL具塞离心管中，加入适量混合标准溶液（4.17），制成链霉素、双氢链霉素和卡那霉素含量均为5.0μg/kg、10.0uμg/kg、20.0μg/kg100.0μg/kg和200.0μg/kg的基质标准溶液。其余按7.1步骤操作完成。7.3测定条件
7.3.1液相色谱参考条件
色谱柱：AtlantisCrs，3.5μm，150mm×2.1mm(内径)或相当者；a)
柱温：40℃；
进样量：30μL；
流动相：流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为0.1%甲酸乙睛溶液，流动相C为甲醇梯度洗脱参考条件见表1。
时间/min
质谱参考条件
流速/（μL/min）
离子源：电喷雾离子源（ESI)；b)
扫描方式：正离子扫描；
液相色谱梯度洗脱参考条件
流动相A/%
检测方式：多反应监测（MRM）；电喷雾电压（IS)：5000V；
辅助气（AUX)流速：7L/min；
辅助气温度（TEM)：550℃；
聚焦电压（FP）：150V；
链霉素、双氢链霉素和卡那霉素的质谱参数见表2。流动相B/%
表2链霉素、双氢链霉素和卡那霉素的质谱参数化合物名称
链霉素
(streptomycin)
双氢链霉素
(dihydrostreptomycin)
卡那霉素
(kanamycin)
定性离子对
582/263
582/246
584/263
584/246
485/163
485/324
定量离子对
582/263
584/263
485/163
去簇电压(DP)/
采集时间/
流动相C/%
碰撞能量(CE)/
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7.4液相色谱-串联质谱测定
7.4.1定性确证
每种被测组分选择1个母离子，2个以上子离子，在相同试验条件下，样品中待测物质的保留时间与混合基质标准校准溶液中对应组分的保留时间偏差在士2.5%之内；且样品谱图中各组分相对离子丰度与浓度接近的混合基质标准校准溶液谱图中对应的相对离子丰度进行比较，偏差不超过表3规定的范围，则可判定样品中存在对应的待测物。表3定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度K
允许最大偏差
7.4.2定量测定
2010以%表示
K≤10
外标法定量：在仪器最佳工作条件下，对链霉素、双氢链霉素和卡那霉素的混合基质标准校准溶液进样测定，以混合基质标准校准溶液浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对待测样品进行定量，样品溶液中待测物的响应值均应在仪器测定的线性范围内。链霉素、双氢链霉素和卡那霉素的多反应监测（MRM)色谱图参见附录A中的图A.1。链霉素、双氢链霉素和卡那霉素的添加浓度及其平均回收率的试验数据参见附录B中的表B.1。7.5平行试验
按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。7.6空白试验
不称取样品，其余均按试样步骤进行。7.7回收率试验
阴性样品中添加标准溶液，按7.1和7.2操作，测定后计算样品添加的回收率。8结果计算
链霉素、双氢链霉素和卡那霉素的残留量按式(1)计算：V1000
式中：
X-一试样中被测组分残留量，单位为微克每千克（ug/kg）；c———从标准工作曲线得到的被测组分溶液浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；V一—样品溶液最终定容体积，单位为毫升mL）；样品溶液所代表最终试样的质量，单位为克（g）。m
计算结果应扣除空白值。
9精密度
9.1一般规定
本标准的精密度数据是按GB/T6379.1和GB/T6379.2规定确定的，重复性和再现性的值以95%的可信度来计算。
9.2重复性
在重复性试验条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r。链霉素、双氢链霉素和卡那霉素的添加浓度范围及重复性方程见表4。4
化合物名称
链霉素
双氢链霉素
卡那霉素
表4添加浓度范围及重复性和再现性方程添加浓度范围
5.0~200.0
5.0~200.0
5.0~200.0
注：m为两次测定结果的算术平均值重复性限r
lgr=1.1141lgm-1.0366
lg r=1. 2478 lgm-1.086 1
lgr=0.8670lgm-0.8214
GB/T22954—2008
单位为微克每千克
再现性限R
lgR=0.9080lgm-0.8333
lgR=1.0584lgm-0.9876
lgR=0.7085lgm-0.6047
如果差值超过重复性限r，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定再现性
在再现性试验条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R。链霉素、双氢链霉素和卡那霉素的添加浓度范围及再现性方程见表4。5
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附录A
（资料性附录）
多反应监测（MRM）色谱图
链霉素、双氢链霉素和卡那霉素的多反应监测（MRM)色谱图见图A1。15000-
05000-
25000-
15000-
链霉素
582/263
双氢链霉素
584/263
卡那霉素
485/163
图A.1链霉素、双氢链霉素和卡那霉素的多反应监测(MRM)色谱图6
附录B
（资料性附录）
回收率
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链霉素、双氢链霉素和卡那霉素的添加浓度及其平均回收率的试验数据见表B.1。表B.1链霉素、双氢链霉素和卡那霉素的添加浓度及其平均回收率的试验数据化合物名称
链霉素
双氢链霉素
卡那霉素
添加浓度/
(μg/kg)
河豚鱼
平均回收率/%
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