本标准规定了河豚鱼、鳗鱼中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量液相色谱?紫外检测方法。本标准适用于河豚鱼、鳗鱼中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量的测定。 GB/T 22961-2008 河豚鱼、鳗鱼中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量的测定 液相色谱-紫外检测法 GB/T22961-2008 标准下载解压密码：www.bzxz.net

ICS67.050
中华人民共和国国家标准
GB/T22961—2008
河豚鱼、鳗鱼中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量的测定液相色谱-紫外检测法
Determination of oxytetracycline,tetracycline,chlortetracyclinedoxycycline residues in fugu and eelHPLC-UV method
2008-12-31发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2009-05-01实施
GB/T22961—2008
本标准修改采用AOAC标准995.09《可食动物组织中土霉素、四环素、金霉素残留量的测定液
相色谱法》。
本标准与AOAC标准相比主要技术差异如下：Ci8固相萃取柱改为OasisHLB固相萃取柱。淋洗液由甲醇改为乙酸乙酯。
增加了羧酸型阳离子交换柱净化增加了测定品种。
本标准的附录A、附录B为资料性附录。本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局本标准主要起草人：曹彦忠、石玉秋、贾光群、顾晓鹏、庞国芳I
1范围
河豚鱼、鳗鱼中土霉素、四环素金霉素、强力霉素残留量的测定液相色谱-紫外检测法
GB/T22961—2008
本标准规定了河豚鱼、鳗鱼中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量液相色谱-紫外检测方法。本标准适用于河豚鱼、鳗鱼中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量的测定。本标准的方法检出限均为0.010mg/kg。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义(GB/T6379.1—2004,ISO5725-1:1994,IDT)GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法（GB/T6379.2—2004,ISO5725-2：1994，IDT）GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682-2008，ISO3696：1987,MOD）3原理
用0.1mol/LNaz2EDTA-Mcllvaine(pH=4.0土0.05）缓冲溶液提取河豚鱼、鳗鱼中四环素族抗生素残留，提取液经离心后，上清液用OasisHLB\或相当的固相萃取柱和羧酸型阳离子交换柱净化，液相色谱-紫外检测器测定，外标法定量。4试剂和材料
除另有说明外，所用试剂均为分析纯。4.1水：GB/T6682，—级。
4.2甲醇：色谱纯。
4.3乙：色谱纯。
4.4、乙酸乙酯：色谱纯。
4.5正已烷：色谱纯。
4.6柠檬酸(C,H.O,·H,O)。
4.7磷酸氢二钠。
4.8乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA·2H,O)。4.9草酸。
4.10甲酸：优级纯。
1）OasisHLB固相萃取柱是Waters公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。1
GB/T22961—2008
4.110.1mol/L柠檬酸溶液：称取21.01g柠檬酸（4.6），用水溶解，定容至1000mL。4.120.2mol/L磷酸氢二钠溶液：称取28.41g磷酸氢二钠（4.7），用水溶解，定容至1000mL。4.13Mcllvaine缓冲溶液：将1000mL0.1mol/L柠檬酸溶液（4.11)与625mL0.2mol/L磷酸氢二钠溶液（4.12）混合，用NaOH或HCI调pH=4.0士0.05。4.140.1mol/LNaEDTA-Mcllvaine缓冲溶液：称取60.5g乙二胺四乙酸二钠（4.8）放人1625mLMcllvaine缓冲溶液（4.13）中，使其溶解，摇匀。4.150.01mol/L草酸溶液：称取1.26g草酸（4.9)用水溶解，定容至1000mL。4.162%甲酸溶液：量取2mL甲酸（4.10），用水稀释至1000mL。4.17甲醇溶液（1+19）：量取5mL甲醇（4.2)和95mL水混合。4.18洗脱液：乙睛-甲醇-0.01mo1/L草酸溶液（2+1十7）。4.19土霉素（CAS:2058-46-0）、四环素（CAS：64-75-5）、金霉素（CAS：64-72-2）、强力霉素（CAS:2439014-5)标准物质：纯度95%。
4.200.1mg/mL标准储备溶液：准确称取适量的土霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准物质（4.19），分别用甲醇配成0.1mg/mL的标准储备液。储备液于一18℃存。4.216.0μg/mL中间浓度混合标准溶液：分别吸取0.6mL标准储备溶液（4.20）移至10mL容量瓶中，用甲醇稀释成6.0μg/mL的标准混合溶液。该溶液于一18℃贮存4.22混合标准工作溶液：用洗脱液将中间浓度混合标准溶液（4.21)稀释成0.005μg/mL、0.010μg/mL、0.050μg/mL、0.100μg/mL、0.200μg/mL不同浓度的混合标准工作溶液，混合标准工作溶液需当天配制。
4.23OasisHLB固相萃取柱或相当者：500mg，6mL。使用前分别用5mL甲醇和10mL水预处理，保持柱体湿润。
4.24阳离子交换柱：羧酸型，500mg，3mL。使用前用5mL乙酸乙酯预处理，保持柱体湿润。4.25滤膜0.2μm。
5仪器
5.1液相色谱仪：配有紫外检测器。5.2分析天平：感量0.1mg，0.01g。5.3液体混匀器。
5.4固相萃取装置。
5.5贮液器：50mL。
5.6高速冷冻离心机：最大转速13000r/min。5.7刻度样品管：5mL，精度为0.1mL。5.8真空泵：最大真空度80kPa。5.9振荡器。
5.10具塞聚丙烯离心管。
5.11pH计：测量精度士0.02。
6试样的制备与保存
6.1试样的制备
从全部样品中取出有代表性样品约1kg，充分搅碎，混匀，均分成两份，分别装人洁净容器内。密封作为试样，标明标记。在抽样和制样的操作过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化6.2试样保存
将试样于-18℃冷冻保存。
7测定步骤
7.1提取
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称取6g试样，精确到0.01g，置于50mL具塞聚丙烯离心管（5.10）中，加入20mLNazEDTAMcllvaine缓冲溶液（4.14），于液体混匀器（5.3）上快速混合1min，再用振荡器（5.9）振荡10min，10000r/min离心10min，上层提取液倒入另一具塞离心管中，残渣中再加入15mLNazEDTA-Mcllvaine缓冲溶液，重复提取一次，合并提取液。鳗鱼样品的提取液中加人20mL正已烷，振荡5min，以4000r/min离心5min，弃去正己烷相，水相部分待净化。7.2净化
将提取液（7.1)倒入下接OasisHLB固相萃取柱（4.23)的贮液器（5.5)中，提取液以小于3mL/min的流速通过固相萃取柱，待提取液完全流出后，用5mL甲醇溶液（4.17）洗柱，弃去全部流出液。固相萃取柱减压抽干40min，然后用15mL乙酸乙酯（4.4)洗脱，下接预先处理好的阳离子交换柱（4.24），调节流速小于3mL/min，待乙酸乙酯全部流出后，取下OasisHLB柱，用5mL甲醇淋洗阳离子交换柱，弃去全部流出液。阳离子交换柱减压抽干5min，再用4mL洗脱液（4.18）洗脱，收集洗脱液于5mL样品管中，定容至4mL，过0.2μm滤膜后，供液相色谱-紫外检测器测定。7.3测定条件
7.3.1液相色谱参考条件
色谱柱：BEHCis，1.7μm，50mmX2.1mm（内径）或相当者；a)
流速：0.4mL/min；
柱温：30℃：
检测波长：350nm；
进样量：10μL；
流动相：A：乙睛，B：2%甲酸溶液，梯度洗脱条件见表1。f)
表1梯度洗脱条件
时间/min
7.3.2液相色谱测定
流速/（mL/min）
将混合标准工作溶液（4.22)分别进样，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准工作曲线，用标推工作曲线对样品进行定量，样品溶液中土霉素、四环素、金霉素、强力霉索的响应值均应在仪器测定的线性范围内。在上述色谱条件下，土霉素、四环素、金霉素、强力霉素的参考保留时间见表2。土霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准液相色谱图参见附录A中的图A,1。本方法中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素添加浓度及平均回收率的试验数据参见附录B中的表B.1。
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表2土霉素、四环素、金霉素、强力霉素的参考保留时间化合物中文名称bzxZ.net
土舞素
四环素
金霉素
强力霉素
7.4平行试验
化合物英文名称
oxytetracycline
tetracycline
chlortetracycline
doxycycline
按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。7.5空白试验
除不称取试样外，均按上述步骤同时完成空白试验。8结果计算
保留时间/min
河豚鱼、鳗鱼中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量的测定结果按式(1)计算。X=cx
式中：
试样中被测组分残留量，单位为毫克每千克（mg/kg）；C
一从标准工作曲线上得到的被测组分溶液浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；样品溶液定容体积，单位为毫升（mL）；样品溶液所代表试样的质量，单位为克（g）。计算结果应扣除空白值。
9精密度
9.1一般规定
本标准的精密度数据是按照GB/T6379.1和GB/T6379.2的规定确定的，其重复性和再现性的值是以95%的可信度来计算。
9.2重复性
在重复性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限，河豚鱼、鳗鱼中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素添加浓度范围及重复性方程见表3。表3添加浓度范围及重复性和再现性方程化合物名称
土霉素
四环素
金番素
强力霉素
添加浓度范围
0.010~0.100
0.010~0.100
0.010~0.100
0.010~0.100
注：m为两次测定结果的算术平均值。重复性限？
lgr=0.7662lgm-0.9133
lg r=0. 823 6lg m-1. 000 7
lgr=0.6573lgm0.7361
Igr=1.1171lgm-1.5142
单位为毫克每干克
再现性限R
lgR=0.7471lgm-0.5893
IgR=0.7912lgm-0.6623
lgR=0.6480lgm-0.4106
lgR=1.0096lgm-1.0132
如果差值超过重复性限r，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。9.3再现性
在再现性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R，河豚鱼、鳗鱼中土霉素四环素、金霉素、强力霉素的添加浓度范围及再现性方程见表3。4
附录A
（资料性附录）
标准物质液相色谱图
土霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准物质液相色谱图见图A.1。0.00307
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图A.1土霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准物质液相色谱图5
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附录B
（资料性附录）
回收率
本方法中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素添加浓度及其平均回收率的试验数据见表B.1。表B.1土霉素、四环素、金霉素、强力霉素添加浓度及其平均回收率的试验数据化合物名称
土霉素
四环素
金霉素
强力霉素
添加浓度/(mg/kg）
平均回收率/%
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