本标准规定了河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中烯丙孕素和氯地孕酮残留量的液相色谱-串联质谱测定方法。本标准适用于河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中烯丙孕素和氯地孕酮残留量的确证和定量测定。 GB/T 22962-2008 河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中烯丙孕素、氯地孕酮残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 GB/T22962-2008 标准下载解压密码：www.bzxz.net

ICS67.050
中华人民共和国国家标准
GB/T22962—2008
河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中烯丙孕素、氯地孕酮残留量的测定
液相色谱-串联质谱法
Determination of altrenogest, chlormadinone residuesinfugu,eel and baked eel
LC-MS-MSmethod
2008-12-31发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2009-05-01实施
本标准的附录A、附录B为资料性附录。本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归口。GB/T22962--2008
本标准负责起草单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局。
本标准主要起草人：康海宁、谢丽琪、肖来龙、赵琼晖、张建莹、庞国芳1
1范围
河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中烯丙孕素氯地孕酮残留量的测定
液相色谱-串联质谱法
GB/T22962—2008
本标准规定了河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中烯丙孕素（altrenogest）和氯地孕酮（chlormadinone）残留量的液相色谱-串联质谱测定方法。
本标准适用于河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中烯丙孕素和氯地孕酮残留量的确证和定量测定。本标准方法检出限：烯丙孕素和氯地孕酮的检出限均为0.5μg/kg。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义(GB/T6379.1—2004,ISO5725-1:1994,IDT)GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法（GB/T6379.2-2004，ISO5725-2：1994，IDT）GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682—2008，ISO3696：1987，MOD）3原理
试样在37℃经过16h酶解后，采用乙腈提取试样中残留的烯丙孕素和氯地孕酮，提取液经乙腈饱和正已烷脱脂、固相萃取柱净化。电喷雾离子化，液相色谱-串联质谱检测和确证，外标法定量。4试剂和材料
除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。4.1甲醇：色谱纯。
4.2乙：色谱纯。
4.3正已烷：色谱纯。
4.4甲酸：色谱纯。
4.5乙酸铵：色谱纯。
4.6氯化钠。
4.7乙酸钠。
4.8乙酸。
4.9β-葡萄糖苷酸/硫酸酯酶：116300unit/mL4.10乙酸钠缓冲溶液：0.2mol/L，pH5.2。称取16.4g乙酸钠（4.7）溶解于800mL水中，用乙酸(4.8)调节pH值至5.2,用水定容至1000mL。4.11乙睛饱和正已烷：取500mL正已烷（4.3），加入适量乙睛（4.2），充分振摇后，待两相分层，上层即为乙腈饱和正已烧溶液。
GB/T22962—2008
4.1220%乙腈水溶液：量取20mL乙腈（4.2）和80mL水，混合均勾。4.13样品定容溶液：量取50mL乙睛（4.2）和50mL水，混合均匀，加人0.1mL甲酸（4.4），混合均匀。
4.14.0.005mol/L乙酸铵（含0.05%甲酸）：准确称取0.3854g乙酸铵（4.5），用水溶解并转移至1000mL容量瓶中，加人0.5mL甲酸（4.4），用水定容至刻度线。4.15标准物质：烯丙孕素（CAS：850-50-2）、氯地孕酮（CAS：302-22-7)，纯度均大于99%。4.16标准储备溶液：分别称取适量的烯丙孕素和氯地孕酮标准物质（4.15），用甲醇（4.1)配制成浓度为100mg/L的标准储备溶液，一18℃以下避光保存。4.17混合中间标准溶液I：吸取适量的各标准储备溶液（4.16），用甲醇（4.1)稀释成浓度为1.0mg/L的混合中间标准溶液I0℃～4℃避光保存。4.18混合中间标准溶液Ⅱ：吸取适量的各标准储备溶液（4.16），用甲醇（4.1）稀释，配制成烯丙孕素浓度为1.5mg/L，氯地孕酮浓度为1.0mg/L的混合中间标准溶液Ⅱ，0℃～4℃避光保存。4.19HLB固相萃取柱或相当者：60mg，3mL。使用前用5mL甲醇，5mL水活化，保持柱体湿润。4.20滤膜：0.2μm。
5仪器和设备
5.1液相色谱-申联质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI)。5.2均质器。
5.3旋涡混匀器。
5.4恒温空气浴摇床。
5.5固相萃取装置。
5.6吹氮浓缩仪。
5.7分析天平：感量0.1mg和0.01g。5.8移液器：10μL~100μ和100μL~1000μL。5.9聚丙烯离心管：15mL和50mL，具塞。5.10容量瓶：100mL和1000mL。
5.11离心机：转速不低于5000/min。6试样制备与保存
6.1试样制备
河豚鱼、鳗鱼取连皮的鱼肉，将皮、肉分离后取鱼皮置于微波炉中，加热后连同鱼肉、鳗鱼制品取所有可食部分一并放入组织捣碎机均质，充分混匀，装人清洁容器内，并标明标记。制样操作过程中应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。6.2试样保存
试样于一18℃以下保存，新鲜或冷冻的组织样品可在2℃～6℃贮存72h。7测定步骤
7.1样品提取
称取待测样品5.0g（精确至0.01g）于50mL具塞离心管中，加人10mL乙酸钠缓冲溶液（4.10），30μL葡萄糖苷酸/硫酸酯酶（4.9），旋涡振荡2min，置于37℃恒温空气浴摇床中酶解16h。酶解后的样品溶液冷却至室温后，加人10mL乙睛（4.2），旋涡混匀1min，在往复式振荡器上振荡提取5min，3000r/min离心5min，将上清液转移至另一50mL离心管中。在残渣中加入10mL乙，重复提取2
GB/T22962—2008
一次，5000r/min离心5min，合并乙腈层。在乙提取液中加入5g氯化钠（4.6），旋涡混匀1min，5000r/min离心3min。取上层乙睛层8mL于15mL离心管中，加人4mL乙睛饱和正已烷溶液（4.11），充分振摇，5000r/min离心3min，弃去上层有机溶液。再加人4mL乙睛饱和正已烷溶液，重复上述操作一次。将经脱脂处理后的乙睛提取液置于45℃水浴下吹氮浓缩至2mL，加水定容至10mL，待净化。
7.2净化
将7.1中所得溶液转人活化好的HLB固相萃取柱（4.19)中，以约3mL/min的流速使样液全部通过固相萃取柱，弃去流出液。再分别用3mL20%乙腈水溶液（4.12）、3mL水淋洗，弃去流出液，用真空泵抽干固相萃取柱15min。用3mL乙睛洗脱被测物于15mL离心管中，45℃水浴下吹氮浓缩至近干，用样品定容溶液（4.13）溶解并定容至1.0mL，旋涡混匀后过0.2μm滤膜（4.20），用液相色谱-串联质谱仪测定。
7.3基质空白液和基质混合标准工作液的制备称取阴性样品5.0g（精确至0.01g）于50mL具塞离心管中，按7.1和7.2操作制备基质空白液混合标准工作液根据需要于使用前用基质空白液配制。7.4测定条件
7.4.1液相色谱参考条件
a）色谱柱：Ci：色谱柱，1.7μm，50mm×2.1mm（内径）或相当者；b）柱温：40℃；
进样量：10μL；
流动相、流速及梯度洗脱条件见表1。表1流动相、流速及梯度洗脱条件时间/min
质谱参考条件
流速/（mL/min）
离子化模式：电喷雾离子源；
扫描方式：正离子扫描；
检测方式：多反应监测（MRM)；分辨率：单位分辨率；
电喷雾电压：3000V；
辅助气流速：700L/h；
碰撞气：氩气；
幕帘气流速：50L/h；
i）离子源温度：105℃；
辅助气温度：400℃；
0.005mol/L乙酸铵溶液（含0.05%甲酸）/%50
定性离子对、定量离子对、采集时间、锥孔电压及碰撞能量见表2。甲醇/%
GB/T22962-—2008
化合物名称
烯丙素
氯地孕酮
烯丙孕素和氯地孕酮测定的质谱参数参考保留时间/min
母离子
子离子
采集时间/s
锥孔电压/V
a为定量离子，对于不同质谱仪器，仪器参数可能存在差异，测定前应将质谱参数优化到最佳。7.4.3液相色谱-串联质谱测定
7.4.3.1定性测定
碰撞能量/eV
每种被测组分选择1个母离子，2个以上子离子，在相同试验条件下，样品中待测物质的保留时间与基质标准溶液的保留时间偏差在土2.5%之内；且样品中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的基质混合标准工作溶液中对应的定性离子的相对丰度进行比较，偏差不超过表3规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。
表3定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度K
允许的最大偏差
7.4.3.2定量测定
2010以%表示
K≤10
在仪器最佳工作条件下，对混合基质标准溶液进样，以峰面积为纵坐标，混合基质标准溶液浓度为横坐标绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中待测物的响应值均应在仪器测定的线性范围内。烯丙孕素和氯地孕酮标准溶液的多反应监测（MRM）色谱图参见附录A中的图A.1。烯丙孕素和氯地孕酮的添加浓度及其平均回收率的试验数据参见附录B中的表B.1。7.4.3.3平行试验
按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。7.4.3.4回收率试验
吸取适量混合标准中间溶液，用空白基质溶液稀释成所需浓度的标准工作溶液。阴性样品中添加标准溶液，按7.1和7.2操作，测定后计算样品添加的回收率。8结果计算
试样中烯丙孕素和氯地孕酮的残留量按式（1)计算：X-cXV×1000
式中：
X——试样中被测组分残留量，单位为微克每千克（μg/kg)；-从标准工作曲线得到的被测组分溶液浓度，单位为微克每升（μg/L)；V
样品溶液最终定容体积，单位为毫升（mL）；最终样品溶液所代表的试样质量，单位为克（g）。计算结果应扣除空白值。
9精密度
9.1般规定
.（1)
本标准的精密度数据是按照GB/T6379.1和GB/T6379.2的规定确定的，重复性和再现性的值4
以95%的可信度来计算。
9.2重复性
GB/T229622008
在重复性试验条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r，被测物的添加浓度范围及重复性方程见表4。
表4烯丙孕素和氯地孕酮的含量范围及重复性和再现性方程单位为微克每千克化合物名称
烯丙孕素
氯地孕酮
添加浓度范围
注：m为两次测定结果的算术平均值。样品基质
河豚鱼
河豚鱼
重复性限r
lgr=0.9946lgm-1.065
lgr=0.7202lgm-1.0303
lgr=0.8043lgm-1.1958
lgr=0.7496lgm-
lgr=0.8361lgm-0.8584
lgr=1.2612lgm-1.0845
再现性限R
1gR=0.88831gm-0.6884
lgR=0.8434lgm-0.7602
IgR-0.668 4lgm—0.703 4
IgR=0.6634lgm-0.6361
IgR=0.8167lgm-0.5954
lgR=0.9505lgm-0.6580
如果差值超过重复性限，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。9.3再现性
在再现性试验条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R，被测物的添加浓度范围及再现性方程见表4。
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附录A
（资料性附录）
标准溶液多反应监测（MRM)色谱图烯丙孕素和氯地孕酮标准溶液的多反应监测（MRM)色谱图见图A.1。100
烯丙孕素311.1/227.1
0-mpmpmpmpmpl.lmpm/pmmin
氯地孕酮405/309.2免费标准下载网bzxz
Tmhmmymin
FTTUTTT
烯丙孕素311.1/269.2
TTTTTT
氯地孕酮405/301.3
0-mmmmpmmm/.lpmin
烯丙孕素和氯地孕酮标准溶液的多反应监测（MRM)色谱图附录B
（资料性附录）
回收率
GB/T22962—2008
河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中烯丙孕素和氯地孕酮的添加浓度及其回收率范围试验数据见表B.1。表B.1
河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中烯丙孕素和氯地孕酮的添加浓度及其回收率范围试验数据化合物名称
烯丙孕素
氯地孕酮
添加浓度/
(μg/kg)
河豚鱼
73.9~86.6
72.4~78.9
回收率范围/%
63.6~78.5
73.5~85.0
79.3~93.0
81.2~86.3
80.6~80.5
85.7~95.0
75.6~83.9
72.4~82.4
81.1~87.0
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