本标准规定了河豚鱼、鳗鱼及烤鳗中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚残留量液相色谱-串联质谱测定方法。本标准用于河豚鱼、鳗鱼及烤鳗中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚残留量的测定。 GB/T 22963-2008 河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 GB/T22963-2008 标准下载解压密码：www.bzxz.net

ICS67.050
中华人民共和国国家标准
GB/T22963—2008
河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、已烯雌酚、烷雌酚、、双烯雌酚残留量的测定
液相色谱-串联质谱法
Determination of zearalanol,zearalanone,diethylstilbestrol,hexestrol and dienoestrol residues in fugu,eels and baked eel-LC-MS-MSmethod
2008-12-31发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2009-05-01实施
本标准的附录A、附录B为资料性附录。本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归口。GB/T22963—2008
本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局、中华人民共和国天津出人境检验检疫局。
本标准主要起草人：许泓、吴延晖、何佳、张骏、张曼、林安清、庞国芳。I
1范围
河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、已烯雌酚、已烷雌酚、双烯雌酚残留量的测定
液相色谱-串联质谱法
GB/T22963—2008
本标准规定了河豚鱼、鳗鱼及烤鳗中玉米赤霉醇（zcaralanol)、玉米赤霉酮（zearalanone）、已烯雌酚(diethylstilbestrol）、已烷雌酚（hexestrol）、双烯雌酚（dienoestrol)残留量液相色谱-串联质谱测定方法。本标准用干河豚鱼、鳗鱼及烤鳗中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、口烯雌酚、烷雕酚、双烯雌酚残留量的测定。
本标准的方法检出限：玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、已烷雌酚、己烯雌酚和双烯雌酚为1.0ug/kg。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义(GB/T6379.1--2004,ISO5725-1:1994,IDT)GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法（GB/T6379.2—2004，ISO5725-2：1994，IDT）GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682—2008ISO3696：1987MOD）3原理
用叔丁基甲基醚和乙酸盐缓冲液加酶解剂分别提取试样中残留的玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、已烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚，经硅胶柱净化，用液相色谱-串联质谱仪测定，内标法定量。4试剂和材料
除另有说明外，所用试剂均为分析纯。4.1水：GB/T6682，一级。
4.2叔丁基甲基醚：色谱纯。
4.3甲醇：色谱纯。
4.4乙睛：色谱纯。
4.5乙酸乙酯：色谱纯。
4.6正已烷：色谱纯。
4.7二氯甲烷：色谱纯。
4.8乙酸：优级纯。
4.9乙酸钠(CH.COONa·3H2O)。
4.10氢氧化钠：优级纯。
GB/T22963—2008
4.113mol/L氢氧化钠溶液：称取120g氢氧化钠（4.10)溶于1000mL去离子水中4.12
20.2mol/L乙酸盐缓冲液（pH=5.2）：称取2.52g乙酸（4.8）和12.95g乙酸钠（4.9）溶解于800mL水中，用氢氧化钠溶液（4.11)调节pH值至5.2士0.1,加水定容至1000mL。4.13溶解液：正已烷-二氯甲烷（3十2）。4.14淋洗液：乙酸乙酯-正已烷（3+47）。4.15洗脱液：乙酸乙酯-正已烷（3+2）。4.16β葡糖苷酸酶/硫酸酯复合酶：含β-葡糖苷酸酶124400units/mL，硫酸酯酶3610units/mL。4.17激素及代谢物标准物质：玉米赤霉醇（包括α-玉米赤霉醇和β玉米赤霉醇，各50%）纯度≥97%；玉米赤霉酮，纯度≥97%；已烯雌酚，纯度≥99%；已烷雌酚，纯度≥98%；双烯雌酚，纯度≥98%4.18标准溶液：分别准确称取适量的玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、已烯雌酚、双烯雌酚和已烷雌酚标准物质，用甲醇（4.3）配制成1mg/mL标准贮备溶液。再根据需要以甲醇配制成不同浓度的混合标准溶液作为标准工作溶液，保存于4℃冰箱中。4.19内标标准物质：α-玉米赤霉烯醇-4氛代，纯度≥99%；已烯雌酚-8氛代，纯度≥98%。4.20内标标准溶液：准确称取适量α-玉米赤霉烯醇-4氛代和已烯雌酚-8氛代标准物质，用甲醇（4.3）分别配制成1mg/mL标准贮备溶液。再以甲醇稀释成适用浓度的混合内标工作溶液，保存于4℃冰箱中。
4.21基质提取液：空白样品，除不加人标准工作溶液（4.18）和内标标准工作溶液（4.20）外，其他同7.1.1～7.1.3处理后得到的溶液。4.22基质标准工作溶液：将标准工作溶液（4.18)及内标标准工作溶液（4.20）混合后在氮吹仪中吹干，以基质提取液（4.21)溶解，涡旋30s后即为基质标准工作溶液。4.23硅胶固相萃取柱：500mg，3mL。4.24滤膜：0.2μm。
5仪器
液相色谱-串联质谱联用仪：配有电喷雾电离源。5.1
5.2分析天平：感量0.1mg和0.01g。5.3自动固相萃取仪或固相萃取装置。5.4
高速均质器：转速大于10000r/min。5.5氮气吹干仪。
烘箱：控温精度士1℃。
涡旋振荡器。
5.8离心机：转速大于3000r/min。5.9pH计：测量精度0.3pH单位。5.10
具塞离心管：25mL，50mL。
5.11微量注射器：100μL。
6试样的制备与保存
6.1试样的制备
取有代表性样品500g，绞碎后搅拌均匀，制成实验室样品。试样分为两份，置于样品盒中，密封，并做上标记。
6.2试样保存
将试样于-18℃下保存。
7测定步骤
7.1混合基质标准校准溶液的制备7.1.1样品称取
GB/T22963-—2008
称取5个阴性样品，每个样品为5g（精确到0.1g），将上述样品置于50mL离心管（5.10）中，分别加入适量混合标准工作溶液（4.18），使各被测组分玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、已烷雌酚、已烯雌酚和双烯雌酚的浓度分别为2.5ng/mL、5.0ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL。再分别加人适量内标标准工作溶液（4.20），使其浓度均为10ng/mL。7.1.2提取
加入20mL叔基甲基醛（4.2），在10000r/min均质1min。3000r/min离心5min，将上清液全部转移至另一50mL具塞离心管（5.10）中备用。离心管中的残渣置于通风橱中挥发30min，加入15mL乙酸盐缓冲液（4.12），高速均质1min，3000r/min离心5min，将上清液全部转移至另一25mL具塞试管（5.10)中，并在氮吹仪上于40℃水浴中吹去残余叔丁基甲基醚后，加人80μLβ葡糖苷酸酶（4.16）混匀，于52℃C烘箱中放置过夜。在此缓冲溶液中加入氢氧化钠溶液（4.11)）将溶液pH值调至7，加人10mL叔丁基甲基醚，充分混合，3000r/min离心2min。移取叔丁基甲基醚层与前述的叔丁基甲基醚提取液混合，在氮吹仪上于40℃水浴中吹干。加入1mL溶解液（4.13），涡旋30s溶解，待净化。
7.1.3净化
固相萃取净化条件：用6mL正已烷分两次预洗硅胶柱（4.23），流速均为4mL/min。上样，流速为2mL/min，在样品试管中加入3mL淋洗液（4.14），混合后过柱，流速为2mL/min，用3mL淋洗液以3mL/min的速度淋洗，加人2mL空气以4mL/min的速度吹过硅胶柱。用6mL洗脱液（4.15）洗脱，流速为2mL/min，加人2mL空气以6mL/min的速度吹过硅胶柱，收集洗脱液。将洗脱液在氮吹仪上于40℃水浴中吹干，加入1mL流动相，涡旋30s溶解。溶液过0.2μm滤膜后，供液相色谱-串联质谱测定。
7.2实测样品溶液的制备
称取待测样品5g（精确到0.1g）于50mL离心管中，加入内标工作溶液，使其最终定容浓度均为10ng/mL。按7.1.2和7.1.3操作。7.3空白基质溶液的制备
称取阴性样品5g（精确到0.1g）于50mL离心管中，按7.1.2和7.1.3操作。7.4测定条件
7.4.1液相色谱参考条件bzxZ.net
a）色谱柱：ZORBAXEclipseSB-C8，3.5μm，150mm×4.6mm（内径）或相当者；b）柱温：25℃；
c）流动相：乙腈-水（7+3)；
d）流速：0.5mL/min；
e）进样量：50μL。
7.4.2质谱参考条件
a）离子化方式：电喷雾电离；
b）扫描方式：负离子扫描；
检测方式：多反应监测（MRM)；c
d）离子源温度：350℃；
GB/T22963—2008
雾化气压力：0.083MPa；
气帘气压力0.1240MPa；
辅助气1压力：0.2756MPa；
辅助气2压力：0.2412MPa；
喷雾器电流：-5μA；
电喷雾电压：—4500V；
定性离子对、定量离子对、碰撞气能量和去簇电压见表1。表15种激素及代谢物的定性离子对、定量离子对、碰撞气能量和去簇电压化合物名称
玉米赤霍醇
玉米赤霉酮
α-玉米赤霉烯醇-4氛代
己烯雌酚
双烯雌酚
己烷雄酚
己烯雌酚-8氛代
定性离子对(m/z）
320.6/277.2
321.1/161.0
318.7/160.8
318.7/107.0
322.9/159.9
322.9/130.1
266.9/251.0
266.9/237.1
264.7/249.1
264.7/235.0
269.0/118.9
269.0/134.0
275.0/258.9
275.0/245.0
7.4.3液相色谱-串联质谱测定
7.4.3.1定性测定
定量离子对(m/z)
321.1/277.2
318.7/160.8
322.9/159.9
266.7/251.0
264.7/249.1
269.0/134.0
275.0/258.9
碰撞气能量/V
去簇电压/V
每种被测组分选择1个母离子，2个以上子离子，在相同试验条件下，样品中待测物质和内标物的保留时间之比，也就是相对保留时间，与混合基质标准校准溶液中对应的相对保留时间偏差在士2.5%之内；且样品谱图中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的混合基质标准校准溶液谱图中对应的定性离子的相对丰度进行比较，偏差不超过表2规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。表2定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度K
允许最大偏差
7.4.3.2定量测定
2010以%表示
K≤10
配制系列混合基质标准工作溶液（7.1)分别进样，绘制标准工作曲线。检查仪器性能，确定线性范围。用色谱数据工作站或选取与样品含量接近含有内标的标准工作液进行定量。样品溶液中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、已烯雕酚、己烷雌酚、双烯雌酚的响应值应在工作曲线范围内。标准物质多反应监测（MRM)色谱图参见附录A中的图A.1。本方法中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、已烷雌酚、双烯雌酚添加浓度及其平均回收率的试验数据参见附录B中的表B.1。
7.5平行试验
按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。7.6空白试验
除不称取试样外，均按上述步骤同时完成空白试验。8结果计算
GB/T22963—2008
玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、已烯雌酚、已烷雌酚、双烯雌酚的测定结果按式(1)计算：AA
式中：
试样中被测物残留量，单位为微克每千克（ug/kg）：基质标准工作溶液中被测物的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；试样溶液中被测物的色谱峰面积：基质标准工作溶液中被测物的色谱峰面积试样溶液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；基质标准工作溶液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；基质标准工作溶液中内标物的色谱峰面积；试样溶液中内标物的色谱峰面积；样液最终定容体积，单位为毫升（mL）；试样溶液所代表试样的质量，单位为克（g）。...（1)
计算结果应扣除空白值；玉米赤霉醇和已烯雌酚将2种异构体面积或峰高值相加后以总量计算。9精密度
9.1一般规定
本标准的精密度数据是按照GB/T6379.1和GB/T6379.2的规定确定的，重复性和再现性的值以95%的可信度来计算。
9.2重复性
在重复性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r，鱼肉组织中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、已烯雌酚、已烷雌酚、双烯雌酚的添加浓度范围及重复性方程见表3。表3添加浓度范围及重复性和再现性方程化合物名称
玉米赤霉醇
玉米赤霉酮
己烯雌酚
双烯雌酚
己烷雕酚
添加浓度范围
注：m为两次测定结果的算术平均值。重复性限r
单位为微克每千克
再现性限R
lg r0. 965 6lg m-1. 089 7lg R=0. 962 5lgm-0.712 8lgr=0.9660lgm-1.1445lgR=0.9152lgm—0.6513lgr=0.9844lgm-1.0935lgR=0.2058lgm+0.0119lgr=0.07351gm+0.0016
1gR=1.08131gm-0.7982
lgr=0.9760lgm-1.0445lgR=0.9252lgm-0.6613如果差值超过重复性限r，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。9.3再现性
在再现性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R，鱼肉组织中玉米赤醇、玉米赤霉酮、已烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚的添加浓度范围及再现性方程见表3。5
GB/T229632008
附录A
（资料性附录）
标准物质多反应监测(MRM)色谱图玉米赤霍醇、玉米赤鑫酮、已烯雌酚、已烷雌酚、双烯雌酚标准物质多反应监测（MRM）色谱图见图A.1。
己烯雌酚
己烷雌酚
双烯雌酚
玉米赤霉醇
玉米赤霉酮
玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、已烷雌酚、双烯雌酚标准物质多反应监测（MRM)色谱图7.5
附录B
（资料性附录）
回收率
GB/T22963—2008
本方法中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、已烯雌酚、已烷雌酚、双烯雌酚添加浓度及其平均回收率的试验数据见表B.1。
表B.1玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚添加浓度及其平均回收率的试验数据化合物名称
玉米赤霉醇
玉米赤霉酮
己烯雌酚
双烯雌酚
己烷雌酚
添加浓度/（pg/kg）
平均回收率/%
小提示：此标准内容仅展示完整标准里的部分截取内容，若需要完整标准请到上方自行免费下载完整标准文档。