本标准规定了河豚鱼和鳗鱼中林可霉素、竹桃霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、螺旋霉素、吉他霉素和交沙霉素残留量的液相色谱?串联质谱测定方法。本标准适用于河豚鱼和鳗鱼中林可霉素、竹桃霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、螺旋霉素、吉他霉素和交沙霉素残留量的测定。 GB/T 22964-2008 河豚鱼、鳗鱼中林可霉素、竹桃霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、螺旋霉素、吉他霉素、交沙霉素残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 GB/T22964-2008 标准下载解压密码：www.bzxz.net

ICS67.050
中华人民共和国国家标准
GB/T22964—2008
河豚鱼、鳗鱼中林可霉素、竹桃霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、螺旋霉素、吉他霉素、交沙霉素残留量的测定液相色谱-串联质谱法
Determination of lincomycin, oleandomycin, erythromycin, tilmicosintylosin, spiramycin, kitasamycin and josamycinresidues infuguand eel
LC-MS-MS method
2008-12-31发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2009-05-01实施
本标准的附录A、附录B为资料性附录。本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局。本标准主要起草人：王飞、王海洋、曹彦忠、贾光群、张进杰、石玉秋、庞国芳。GB/T22964—2008
1范围
河豚鱼、鳗鱼中林可霉素、竹桃霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、螺旋霉素、吉他霉素、交沙霉素残留量的测定液相色谱-串联质谱法
GB/T22964—2008
本标准规定了河豚鱼和鳗鱼中林可霉素、竹桃霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、螺旋霉素、吉他霉素和交沙霉素残留量的液相色谱-串联质谱测定方法。本标准适用于河豚鱼和鳗鱼中林可霉素、竹桃霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、螺旋霉素、吉他霉素和交沙霉素残留量的测定。
本标准的方法检出限：河豚鱼中的林可霉素、竹桃霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、螺旋霉素、吉他霉素和交沙霉素均为2.0μg/kg。鳗鱼中的林可霉素、红霉素、泰乐菌素、吉他霉素均为2.0μg/kg，螺旋霉素、竹桃霉素、交沙霉素、替米考星均为5.0μg/kg。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义(GB/T6379.1—2004,ISO5725-1:1994,IDT)GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法（GB/T6379.2—2004，ISO5725-2：1994,IDT）GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682—2008，ISO3696：1987，MOD）3原理
河豚鱼和鳗鱼中林可霉素、竹桃霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、螺旋霉素、吉他霉素和交沙霉素的残留用Tris缓冲溶液提取后，经OasisHLB固相萃取柱\净化，甲醇洗脱，洗脱液浓缩定容后，液相色谱-串联质谱法测定，内标法定量。4试剂和材料
除另有说明外，所用试剂均为分析纯。4.1水：GB/T6682，一级。
4.2甲醇：色谱纯。
4.3乙酸铵。
4.4乙睛：色谱纯。
4.5盐酸。
4.6三羟甲基氨基甲烷（tris):C,HnNOs。1）OasisHLB固相萃取柱是waters公司产品的商品名称，给出这信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。1
GB/T22964—2008
4.7氯化钙：CaCl2·2H20。
4.8甲醇溶液：2+3。400mL甲醇（4.2)与600mL水混合。4.90.01mo1/L乙酸铵溶液：0.77g乙酸铵（4.3）溶解于水中，定容于1000mL容量瓶中。4.10定容液：0.01mol/L乙酸铵溶液（4.9)+乙腈（4.4)（17+3)。4.11tris溶液：称取12.0g三羟甲基氨基甲烷（4.6）、7.35g氯化钙（4.7)溶解于1000mL水中，用盐酸（4.5)调节pH值为9。
4.12标准物质：林可霉素（CAS：7179-49-9）、竹桃霉素（CAS：7060-74-4）、红霉素（CAS：59319-72-1）、替米考星（CAS：108050-54-0）、泰乐菌素（CAS：74610-55-2）、螺旋霉素（CAS：8025-81-8）、吉他霉素（CAS：1392-21-8）、交沙霉素（CAS：16846-24-5）和内标物质罗红霉素（CAS：80214-83-1），纯度≥95%。4.13标准储备溶液I：1.0mg/mL。依次准确称取每种标准物质（4.12)适量，分别放人相应的10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，混勾。4℃保存。4.14标准储备溶液IⅡ：10.0μg/mL。依次吸取0.1mL各标准储备溶液I（4.13），分别放人相应的10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。4℃保存。4.15标准工作溶液：2.0μg/mL。依次吸取2.0mL混合标准储备溶液Ⅱ（4.14），分别放人相应的10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。4.16内标储备溶液：1.0mg/mL。准确称取10.0mg罗红霉素（4.12）于10mL容量瓶中，用甲醇溶解定容至刻度，混匀。4℃保存。4.17中间浓度内标溶液：10.0μg/mL。吸取0.1mL内标储备溶液（4.16）于10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。4℃保存。
4.18内标工作溶液：1.0μg/mL。吸取1.0mL中间浓度内标标准溶液（4.17)于10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。
4.19基质标准混合工作溶液：
测定河豚鱼用基质标准混合工作溶液：分别吸取1.0μL、2.0μL、5.0μL、25.0μL标准工作溶液（4.15），依次加入相应的试剂瓶中，再分别加入20.0μL内标工作溶液（4.18），用样品空白提取液定容至1.0mL。配成林可霉素、竹桃霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、螺旋霉素、吉他霉素和交沙霉素分别为2.0ng/mL、4.0ng/mL、10.0ng/mL、50.0ng/mL的四个浓度水平的系列基质标准混合工作溶液。
测定鳗鱼用基质标准混合工作溶液：分别吸取林可霉素、红霉素、泰乐菌素、吉他霉素各1.0μL、2.0μL、5.0μL、25.0μL标准工作溶液（4.15)和螺旋素、竹桃霉素、交沙霉素、替米考星各2.5μL、5.0μL、10.0μL、25.0μL标准工作溶液（4.15），依次加入相应的试剂瓶中，再分别加人20.0μL内标工作溶液（4.18），用样品空白提取液定容至1.0mL。配成林可霉素、红霉素、泰乐菌素吉他莓素分别为2.0ng/mL、4.0ng/mL、10.0ng/mL、50.0ng/mL和螺旋霉素、竹桃霉素、交沙霉素、替米考星分别为5.0ng/mL、10.0ng/mL、20.0ng/mL、50.0ng/mL的四个浓度水平的系列基质标准混合工作溶液。
4.20OasisHLB固相萃取柱：500mg，6mL，或相当者。使用前，先后用10mL甲醇和10mL水活化，在抽真空前的各步骤中，都保持柱体湿润。4.21滤膜0.2μm。
5仪器
5.1液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源。5.2天平：感量0.01g0.0001g。
5.3固相萃取装置。
5.4氮气浓缩仪。
5.5具塞聚丙烯离心管：50mL。
5.6离心机：20000g离心力（或相当于12000r/min）。5.7超声波清洗仪。
5.8pH计。
5.9振荡器。
试样制备与保存
6.1试样的制备
GB/T22964—2008
从全部样品中取出有代表性样品约1kg，充分搅碎，混匀，均分成两份，分别装人洁净容器内。密封后作为试样，标明标记。在抽样和制样的操作过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。
6.2试样的保存
将试样于一18℃保存。
7测定步骤
7.1提取
称取5g试样，精确至0.01g，置于50mL离心管（5.5）中，加人20.0μL内标工作溶液（4.18）和10.0mLtris溶液（4.11），于振荡器上剧烈振荡10min。以12000r/min转速离心10min，取上清液以小于1.0mL/min的流速通过OasisHLB固相萃取柱（4.20）。再加人10.0mLtris溶液（4.11），于振荡器上剧烈振荡10min。以12000r/min转速离心10min，取上清液以小于1mL/min的流速通过Oasis HLB固相萃取柱。
7.2净化
待样液全部流出后，先后用10mL水和10mL甲醇溶液（4.8）洗柱，弃去全部流出液，将固相萃取柱用真空泵抽干1h。再用10mL甲醇（4.2)洗脱于15mL氮吹管中，用氮气浓缩仪于50℃水浴中吹至近干，准确加入1.0mL定容液（4.10），于超声波仪中超声波助溶残渣。用阴性样品，按上述步骤制备空白样品提取液。过0.2μm滤膜（4.21)后，供液相色谱-串联质谱仪测定。按上述操作步骤，制备用于配制系列基质标准工作溶液的空白样品提取液。7.3测定条件
液相色谱参考条件
色谱柱：AtlantisCis，内径3μm，150mm×2.1mm（内径）或相当者；a)
流动相A：乙睛；
流动相B：0.1%甲酸水溶液；
流动相C:甲醇；
梯度洗脱条件：见表1；
流速：0.2mL/min；
柱温：30℃；
进样量：20μL。
表1梯度洗脱条件
时间/min
GB/T22964—2008
质谱条件参考条件
离子源：电喷雾离子源；
扫描方式：正离子扫描；
检测方式：多反应监测；
电喷雾电压：5500V；
雾化气压力：0.24MPa；
辅助气流速：0.4L/min；
离子源温度：550℃；
碰撞室出口电压：2.0V；
定性离子对、定量离子对、碰撞气能量和去簇电压：见表2。林可霉素、竹桃霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、螺旋霉素、吉他霉素和交沙霉素表2
定性离子对、定量离子对、碰撞气能量和去簇电压化合物中文名称
林可霉素
竹桃霉素
红霉素
替米考星
泰乐菌素
螺旋霉素
吉他霉素
交沙霉素
化合物英文名称
（定性离子对（m/z）
lincomycin
oleandomycin
erythromycin
tilmicosin
tylosin
spiramycin
kitasamycin
josamycin
7.4液相色谱-串联质谱测定
7.4.1定性测定
407/126
407/359
688/158
688/544wwW.bzxz.Net
734/158
734/576
869/174
869/132
916/174
916/145
843/142
843/174
772/215
772/109
828/174
828/109
定量离子对(m/z)
407/126
688/158
734/158
869/174
916/174
843/142
772/215
828/174
碰撞气能量/V
去簇电压/V
被测组分选择1个母离子，2个以上子离子，在相同的试验条件下，样品中待测物质的保留时间与标准溶液中对应的保留时间偏差土2.5%之内；且待测样品溶液中，被测物中各定性离子相对丰度与浓度接近的基质标准工作溶液中被测物的各定性离子相对丰度的比值K，偏差不超过表3规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。表3定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度K
允许最大偏差
7.4.2定量测定
2010以%表示
K≤10
在仪器的最佳工作条件下，用基质标准混合工作溶液（4.19)分别进样，以各标准溶液中被测组分峰4
GB/T22964—2008
面积与内标物峰面积的比值为纵坐标，以各标准溶液被测组分浓度（ng/mL)与内标物浓度的比值为横坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量。用基质标准混合工作溶液的工作曲线对样品进行定量，应使样品溶液中林可霉素、竹桃霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、螺旋霉素、吉他霉素和交沙霉素的响应值在仪器测定的线性范围内。在上述色谱条件和质谱条件下，林可霉素、竹桃霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、螺旋霉素、吉他霉素和交沙霉素的参考保留时间见表4。表4林可霉素、竹桃霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、螺旋霉素、吉他霉素和交沙霉素参考保留时间
化合物名称
林可霉素
竹桃霉素
红霉素
替米考星
泰乐菌素
螺旋霉素
吉他霖素
交沙霉素
保留时间/min
林可霉素、竹桃霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、螺旋霉素、吉他霉素和交沙霉素的标准物质多反应监测（MRM)色谱图参见附录A中的图A.1、图A.2、图A.3、图A.4、图A.5、图A6、图A.7、图A.8。林可霉素、竹桃霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、螺旋霉素、吉他霉素和交沙霉素添加浓度及其平均回收率的试验数据参见附录B中的表B.1。7.5平行试验
按试样步骤，对同一试样进行平行试验测定。7.6空白试验
不称取样品，其余均按试样步骤7.1和7.2进行。8结果计算
林可霉素、竹桃霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、螺旋霉素、吉他霉素和交沙霉素的测试结果按式(1)计算：
式中：
×-6×××会××1%
￥V1000
一试样中被测物残留量，单位为微克每千克（ug/kg）；c
基质标准工作溶液中被测物的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；试样溶液中被测物的色谱峰面积；A
A，一—基质标准工作溶液中被测物的色谱峰面积；试样溶液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL)；G
基质标准工作溶液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；A基质标准工作溶液中内标物的色谱峰面积；试样溶液中内标物的色谱峰面积；A
样液最终定容体积，单位为毫升（mL)；（1)
GB/T22964—2008
试样溶液所代表试样的质量，单位为克（g）。计算结果应扣除空白值。
9精密度
9.1一般规定
本标准的精密度数据是按照GB/T6379.1和GB/T6379.2的规定确定的，其重复性和再现性的值是以95%的可信度来计算。
9.2重复性
在重复性试验的条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r，河豚鱼和鳗鱼中林可霉素、竹桃霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、螺旋霉素、吉他霉素和交沙霉素添加浓度范围及重复性方程见表5。
表5林可霉素、竹桃霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、螺旋霉素、吉他霉素和交沙霉素添加浓度范围及重复性和再现性方程化合物名称
林可霉素
竹桃霉素
红霉素
替米考星
泰乐菌素
螺旋霉素
吉他霉素
交沙霉素
添加浓度范围
注：m为两次测定值的算术平均值。重复性限+
单位为微克每千克
再现性限R
lgr=1.031 9lgm—1.019 9
1gR=1.18791gm-0.6782
lgr=0.7337lgm-0.7835
Igr=0.9962lgm-1.0136
lgr1.2925lgm1.2341
lgr=0.8905lgm-1.0104
Igr=1.0276lgm-
lgr=0.9403lgm-1.0077
lgr=0.8163lgm-0.9362
lgR=0.8225lgm-0.4402
lgR0.9399lgm-0.4795
lgR=1.0931Igm—0.5760
lgR0.9828lgm0.5994
lgR=0.8969lgm
lgR=0.9771lgm-0.5434
lgR=0.9073lgm-0.5037
如果差值超过重复性限，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。9.3再现性
在再现性试验的条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R，河豚鱼和鳗鱼中林可霉素、竹桃霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、螺旋霉素、吉他霍素和交沙霉素的添加浓度范围及再现性方程见表5。
附录A
（资料性附录）
标准物质多反应监测（MRM）色谱图GB/T22964—2008
林可霉素、竹桃霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、螺旋霉素、吉他霉素和交沙霉素标准物质多反应监测（MRM)色谱图，分别见图A.1、图A.2、图A.3、图A.4、图A.5、图A.6、图A.7、图A.8。响应值
响应值
响应值
3. 00 e4-
响应值
林可霉素标准物质多反应监测（MRM)色谱图7.36
竹桃霉素标准物质多反应监测（MRM)色谱图图A.2
红霉素素标准物质多反应监测（MRM)色谱图8.36
替米考星标准物质多反应监测(MRM)色谱图14
GB/T22964—2008
响应值
响应值
响应值
响应值
2. 00 e4-
泰乐菌素标准物质多反应监测（MRM)色谱图图A.5
螺旋霉素标准物质多反应监测（MRM)色谱图8.83
吉他霉素标准物质多反应监测（MRM）色谱图9.14
交沙霉素标准物质多反应监测（MRM）色谱图14
附录B
（资料性附录）
回收率
GB/T22964—2008
本方法中林可霉素、竹桃霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、螺旋霉素、吉他霉素和交沙霉素添加浓度及其平均回收率的试验数据见表B.1。表B.1林可霉素、竹桃霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、螺旋霉素、吉他霉素和交沙霉素添加浓度及其平均回收率的试验数据化合物名称
林可霉素
竹桃霉素
红霉素
替米考星
泰乐菌素
螺旋霉素
吉他霉素
交沙霉素
添加浓度/(μpg/kg)
平均回收率/%
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