本标准规定了奶粉、牛奶中链霉素、双氢链霉素和卡那霉素残留量液相色谱-串联质谱测定方法。本标准适用于奶粉、牛奶中链霉素、双氢链霉素和卡那霉素残留量的测定。 GB/T 22969-2008 奶粉和牛奶中链霉素、双氢链霉素和卡那霉素残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 GB/T22969-2008 标准下载解压密码：www.bzxz.net

ICS 67.050
中华人民共和国国家标准
GB/T22969—2008
奶粉和牛奶中链霉素、双氢链霉素和卡那霉素残留量的测定
液相色谱-串联质谱法
Determination of streptomycin, dihydrostreptomycin and kanamycirresidues in milk and milk powder-LC-MS-MS method
2008-12-31发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2009-05-01实施
本标准的附录 A,附录 B为资料性附录。本标推山中华人民共和国国家质量监替检验检疫总局提出并归口。本标推起草单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局本标准主要起草人：刘晓茂,张习军,张进杰,曹彦忠，曹亚平、杨志伟、庞国芳。http：//foodmate.netGB/T 22969--2008
1范围
奶粉和牛奶中链霉素、双氢链霉素和卡那霉素残留量的测定
液相色谱-串联质谱法
GB/T 22969—2008
本标准规定了奶粉、牛奶中链霉素、双氢链罹素和卡那惩素残留氧液相色谱-串联质谱测定方法。本标推适用于奶粉、牛奶中链霉紊，双氢链霉素和卡那霉索残留量的测定。本标准的方法检出限：牛奶中链霉素.双氢链霉索和卡那链素的检出限均为10.0μ/k,奶粉中链霉索、双氨链素和卡那霉素的检出限均为80.1g/kg2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有的修改单（不也括谢误的内容）或修订版与不适用十本标推，然而，鼓励根锯本标谁达成迹议的备方研究是否可使用这些文件的晟新版本。凡是不注口期的引用文件，其最新版木适用于本标推。GB/T 6379. 1 测量方法与结果的准确度(正确度与精密度）第 1 部分:总则与定义(GB/T 6379. 12004,1SO5725-1.1994,1D)
GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标推测量方法重复性与再现性的基本方法（GB/T6379.22004,JSO5725-2:1994,IDI)GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GR/T6682-2008,IS03696：1987,MOD）3原理
奶粉或牛奶试样中的抗生素用磷酸游液提双，三氛7.酸沉淀蛋白，用苯磺酸型和胶殴型固相萃取柱净化液相色谱-串联质谱仪(ESI十)检测,外标法建前，4试剂和材料
除另有说明外，所用试剂均为优级纯。4.1水:GB/T 6682,---级.
4.2甲醇：色谱纯。
4.3乙腈：色谱纯。
4.4甲酸。
4.5依磷酸
4.6磷酸氢二钾(K,HPO,）。
4.7三氯乙酸(C,HCl,O,)。
4.8庚烷磺酸钠(C,HsNaO,SH,0)。4.95%磷酸洛液(1一19):取50 tL浓磷酸(4.5),用水定容至1 L。4.100.2I01/L磷酸盐缓冲溶液：pH=8.5。称取34.8名磷酸氧二钾（4.6)用水溶解，定容充1T用氢氧化钠溶液调节pII=8.5。
4.11三氯乙酸溶液：i0%（质量分数）。取20g三氟乙酸（4.7),用水定容至20ml。4.120.01mol/L庚烷磺酸钠溶液：称取 2.20 g庚烷磺酸钠(4.8),用水溶解,定容全1L。1
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CB/T22969—2008
4.13SPE洗脱溶液：取4 mL甲酸(4.4),用 0.0i rioi/1.烷磺酸钠落液(4.12)定穿至100 n:L。4.1425%甲醇溶液（1+3）：取25ml_甲醇（4.2)，用水定容至[00)ml4.15
标摊物质：链霉素（CAS：3810-74-0）、双氧链霉素（CAS：28-46-）和卡那霉素(CAS:25389-94-0)纯度均大于等于98%。4.161.0mg/ml.标难储备溶液：称取适量的链霉素、双氢链赛素和卡那霉素标准物质（4.15)，分别用0.3%乙酸水溶液溶解并配制成1.0mg/mL的标准储备溶液。避光保存于-18℃冰柜中。4.170.1pg/1nL混合标准溶液：吸取适量链霉素、双氢链霉素和卡那霉素标准储备溶液（4.16）、用0.3%乙酸水稀释成0.1μg/ml.的混合标准溶液。避光保存于一18℃冰柜巾。4.18苯磺酸型固相萃取柱（50mg3ml)或相当者。使用前依次用5mL甲醇利1Cml水预处理，保持柱体泥润。
4.19羧酸型固相举最柱（500mg，3ml)或相当者。使用前依次用5ml甲醇和10mL水预处理，保CHINA
持柱体湿润。
4.20滤膜：0.2um。
5仪器
液相色谱-串联四
分析天平：感
波体混勾器bzxZ.net
固相萃取装
振荡器。
真空泵：真容
微量注射器
质谱仪
配有电喷雾离子源
达到80kP
pH计：测量
具塞离心管
刻度离心管
液器：50m
离心机：转速
试样的制备与保存
L0.02p单位
试样的制备
实验室样品退合均匀，分kg准为试样。6.2试样保存
试样置于—18℃冰柜，避光保存。7测定步骤
7.1待测样品溶液的制备
7.1.1牛奶样品提取和初净化
称取牛奶样品8g(精确到0.01g），置于1.03mL离心管中1,加人30mL5%磷酸溶波(4.9置于振荡器上振荡提取10min，加入3mL三氯乙酸溶液（4.11)涡旋混合后在4000)t/min下离心10min，清液全部倒人下接苯磺酸型固相率取柱（4.18）的液器中，在固相萃取装置上使样液以小丁2mL/1ir的流速通过萃苯柱，待样液全部通过固相萃取柱片，依次用5rnL5%磷酸溶(4.9)和10ml.水洗涤举磺酸型固相萃取柱（4.18），弃去全部流出液，用20InL磷酸盐缓冲溶液（4.10)洗税至50ml.离心管中。
http://foodmate.net7.1.2奶粉样品提取和初净化
GB/T 22969—2008
称取奶粉样品1（精确到0.0g），鹭十100离心管山，加人8加L水，涡旅混合后，再班人30 ul磷酸液(4.9），置于振药器上振薄提取19 Lin,加人 3 mL 三氯乙酸溶液(4,11)涡旋混合后在10001/min下离心10 :in。上清液全部倒人下接苯锁酸型固相萃敢柱(4.18)的贮液器中，在固相茎瑕装置上使样液以小于2.tal./rmin的流速通过萃取柱，待群液全部通过固相萃取柱后，依次用！mL5%磷酸溶液(4.9)和10 mL水洗苯横酸型固相苯取柱(4.18),弃去仑部流出液。用20 mL磷酸盐缓冲溶液（4.10）洗脱至50mL离心管中。7.1.3样品溶液再净化
上述洗脱液倒人下接羧酸型固相本取柱（4.19)的贮液碟中，在固相萃取装置上使样液以小于2ml,/irlin的流速通过举取柱，待样液全部通过固相萃取柱后，依次用10mL水和10mL25%甲醇溶液(4.14)洗羧酸型固相萃取柱(4.19）并去全部流出液，减压抽于羧酸型固相萃取柱（4.19)30 r:in,用2mL.SPE洗脱液(4.13)洗脱至5mL刻度离心管中,用SPE先脱液（413)定容至2.0mL，混勾后过0.2μm滤膜（4.20）供费用色谱申联质谱测定。7.2基质混合标准校准咨液的制备7.2.1牛奶基质洞合标准校准溶液的制备称联五个阴性奶辉品10g（精确到091名）液（4.17)，制成素、双氢链霉素和卡那分别置于100m
海素合
约为50
100.0μg/kg和200.0μg/kg的基质标准榕液，其余按
7.2.2奶粉基质合标准校准溶商的制备具塞离心管中，加人适量混合标准o
kg.20. 0 μg/ kg、
7和7.1.2步骤操作完成。
称取五个粉样品1g精确到0
01-8）分别置
溶液（4.17)，制素、双氢链毒素和卡那霉素含量均为40。具塞离心管中，加人适量混合标准ug/kg.80.
O μg kg、160. C μg/kg.
.2和.1.3步骤架作究成。
ho0.0ug/kg的基质标准溶液。
800.0μg/kg和
7.3测定条件
7.3.1波相色谱参者条件
液相色谱蚕D作如下：
a）色谱柱：
其茶被
m，159mm大2mm（内轻）或相当者Hris Ca.3.
b）柱温：40
c）进样量：30
0A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为0.1%甲酸乙脂溶液，流动相C为甲醇流动相：流型
梯度洗脱参考条件见表
时间/muin
7.3.2质谱参考条件
流速/(/min)
质谱参考条件如下：
离子源：电喷雾离了源（ESI）；b)
扫描方式：正离子扫描；
检测方式：多反应监测（MRM)；液相色谱梯度洗脱参考条件
流动相A/%
httn
流动相 B/ %
流动机 C/%
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电喷雾电压(1S):5 000 V;
辅助气（AUX)流速：7L/min；
辅助气温（TEM)：550C：
聚焦电E(FP)：150 V;
链霉素，双链霉素和卡郡猫素的质参数见表2。表 2链翠素、双氢链雾素和卡那霉的质谱参数化合物名称
键番素
(strepronrycin )
双宝素
(dihydrosrreptomycin)
卡郡莓素
(kznamycin)
定性离子对
(zn/z)
582/263
582/246
684/263
584/246
485/163
485/324
7.4液相色谱-串联质谱测定
7.4.1定性确证
定量子对
(rn/z)
582/263
584/263
185/163
去旗电压(DP)/
采集时间/
碰撞能整(CE)/
每种被测分选择「个母离子，2个以上子离子，在相同实验条作下，样品中待测物质的保留吋间与混合基质标准校准落液中对应组分的保留时间偏差在上2.5%之内;且样品谱图中各组分的相对离子丰度与浓度接近的混合基质标准校准裕液谱图中对应的相对离子丰度进行比较，偏差不超过表3规定的范围，则可判定样品中存在对应的待测物。表 3定性确证时相对离子率度的最大允许偏差相对离子季:库 K
允诈最大痛差
7. 4. 2 定量测定
10-K-29
上:30
外标法定单：在仪豁最佳工作条件下，对链等素、双氧链篝素和卡那篝素的混合势质标推校雅掩液进样测定，以混合基质标准校准溶液浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对待测样品进行定量，样品溶液中待测物的响应值均应在仪器测定的线性范闺内。链霉素、双氨链霉紊和卡那素的多反应监测(MRM)色谱图参见附录A 山的图A.1.链霉素、双笔链考和卡那舞素的获加获度及基平回妆率的试验数据州附录B中的表B1。7.5平行试验
按以上步骤,对同一试样进行平行试验测定。7.6空白试验
不称取样品，其余均按试样步骤进行，7.7回收率试验
阴性样品中添加标推溶，按7.1和7.2 操作,测定后计算样品添加的回收率。8结果计算
链素,双氢链素和卡那素的测定按式(1)计算：X=ex
btt
武市：
-试样中被测组分我留量，单位为微克每千克（ug/kg）GB/T 22969—2008
从标工作曲线得到的被测组分溶液浓度，单位为纳克每毫升(ng/mI.)；-样品溶液最终定容体积，单位为毫升（mL）：-样品溶液所代表最整试样的质量，单位为克（）。计算结果应抑除空白值。
9精密廣
9.1一般规定
本标准的精密度数据是按 CB/T 6379. 1和 GB/T 6379. 2 规定确定的,重复性和再现性的值以95%的可信度来计算。
9. 2量复性
在重复性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r。链霉素，双氢链酶素和卡那书紊的恭加浓度范图及重复性方程见表4。表4添加浓度范围及重复性和再现性方程化合物名称
链毒素
双氢链霉素
卡那霉素
添加浓度范围
5. 0~200. 0
5,0~~200,0
5. 0~-200, 0
注：m 为两欲测定结果的算术平均值。重复性限
lg r=0. 844 8 lg m-0. 842 8
lg r=0, 899 0 lg m-0. 950 8
Igr=0.8896lgm-0.9208
单位为微克每干克
再现性限R
lg R=0. 910 2 lg m-0. 811 5 lg R=0. 944 9 Ig m-0. 920 5
1g R 0. 726 3 g m - 0. 691 6如果差值超过重复性限r,应含弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。9.3再现性
在再现性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R。链霉素、双氢链霉素和卡那霉素的添加度范围及再现性方琵见表4。5
bt
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附录A
(资料性附录）
多反应监测(MRM)色谱图
链霉素,双氢链霉素和卡那霉素的多反应监测(MRM)色谱图,见图 A,1。15 0c0
12 000 -
6000 -
30 000
25G00-
20 C00 -
582/263
siame:
双舞素
5B4/263
485/163
Ticain
链害素,双氢链霉素和卡那霉素的多反应监测(MRM)色谱图bttn
附录B
(资料性附录）
回收率
GH/T22969-—2008
链避素、双氢链避素和卡那藓素的添加浓度及其平均回收率的试验数据，见表B,1。链琴素、双氢链每素和卡那霉素的添加浓度及其平均回收率的试验数据表B. 1
牛奶样品
平均回收率/%
添加浓度/
(μg/kg)
韩幕察
双氢链辉素
卡邯霉素
httn：
添加浓度/
(μg/kg)
链霉素
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奶粉样品
乎均回收率/%
双氢链霉素
卡那寒素
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