本标准规定了牛奶和奶粉中氮氨菲啶残留量的液相色谱-串联质谱测定方法。本标准适用于牛奶和奶粉中氮氨菲啶残留量的测定。 GB/T 22974-2008 牛奶和奶粉中氮氨菲啶残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 GB/T22974-2008 标准下载解压密码：www.bzxz.net

ICS67.050
中华人民共和国国家标准
GB/T22974—2008
牛奶和奶粉中氮氨菲残留量的测定液相色谱-串联质谱法
Determination of isometamidium residues in milk and milk powder-LC-MS-MSmethod
2008-12-31发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
赶码防件
2009-05-01实施
本标准的附录A、附录B为资料性附录前言
GB/T22974—-2008
本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口本标准主要起菲单位：中华人民共和国案望岛出人境检验检疫局，中华人民共和国内蒙古出人境检验检疫局、内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司，本标准主要起草人：潘国卿、张春艳、白国涛、刘来俊、郑书展、李红、张伟、常建军、李梅、庞国芳、http：//
1范围
牛奶和奶粉中氮氨菲啶残留量的测定液相色谱-串联质谱法
本标准规定了牛奶和奶粉中氮氨菲啶残留量的液相色谱串联质谱测定方法。本标准适用于牛奶和奶粉中氮氨非啶残留量的测定。本标准方法检止限：牛奶为0.01cmg/kg.奶粉为0.080mg/kg2规范性引用文件
GB/T22974-2008
下列文件中的条款通过木标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括尚误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓感根据本标准达成协汉的各方研究是否可使用这世文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义（GB/T6379.42004.ISO5725-1.1994.IDT)
GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法（GB/T6379.2-2004,ISO.5725-2:1954.IDT)GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682-2008，ISO3696：1987，MOD）3方法原理
试样中的氨氨菲啶用乙和甲酸铵甲醇混合溶液提取，提取液经浓缩、脱脂后，用液相色谱串联质谱仪测定，外标法定量，选择离子定性，试剂和材料
除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为CB/T6582规定的一级水。4.1甲醇：色谱纯
甲酸：色谱纯。
4.3乙精：色谱纯。
4.4正色烷：色谱纯
4.5甲酸铵。
4.60.25mo1/L甲酸铵甲醇溶液：称取15.76g甲酸铵（4.5）溶于1c00mL甲醇（4.1）中4.780%甲避水溶液：量取80mL甲醇（4.1）加人20mL水中。4.8饱和了80%甲醇水的正已烧溶液：在分液滑斗中加人300mL正已烷（4.4），取适量80%甲醇水溶液（4.7）进行振荡、静置分层，弃去下层甲醇水溶液，上层正已烧容液备用4.9提取液：量取乙睛（4.3）和0.25m51/L甲酸铵甲醇溶液（4.6）按照1：1（体积比）进行混合4.10氮氨非盐酸盐标准品：纯度大于或等手97%。4.11氧氨菲啶标准储备溶液：准确称取适量氨氨菲啶盐酸盐标准品，用甲醇（4.1）配成浓度为100g/mL的标准储备溶液，此浴液在QC~4C冰箱中避光保存4.12算氨菲晚标准中间液：准确吸取5mL的氮氨菲啶标准储备溶液（4.11）于50mL色容量瓶中，用甲醇（4.1定容至刻度，配制成浓度为1Cμg/mL的氨氨菲旋标准中间液。该溶液于0C～4C冰箱1
http:
GB/T22974—2008
中避光保存
4.13氮氨菲啶基质标准工作溶液：根谱需要吸取造量的氮氨菲啶标准中间液（4.12），用明性样品提取液稀释配制成浓度范国为2.Sng/mL200ng/mL的系列基质标准工作溶液，该溶液应现月现配。4.14滤膜：0.2m。
5仪器和设备
5.1坡相色话串级质谱仪配有电喷雾离子滇（ESI。52
分析天平感量c.01mg和0.01客
振萄器
超声波清洗器，
5.5旋转蒸发器。
5.6旋涡混合器。
高心机：转速不小十1d600r/min试样的制备与保存
试样的制备
6.1.1牛奶：取有代表试群约500g，搅拌均句后装人洁净容器内密封并做好标识6.1.2奶纷：取有代表性试样约500g搅均勾后装入洁净容器内密封并做好标识。准确称取12g乳粉试烊（精确到1g）于250mL烧杯中，少量多次加人50mL蒸沸并冷却到60C左右的水溶解，冷却至室温后，移人00mL容量瓶中，用少量水分次淋洗烧杯，淋洗液一并移人容量瓶，再用水定容到刻度，混勾，制备成奶粉复原乳试样。6.2试样的保存
将试样于4赠以下保存。
测定步骤
7.1提取与净化
催确称取5g牛奶试样（精确到0.01g）或量取5.00mL奶粉复原乳试样（6.12）于50mL具塞离心中，加人20mL提取液（4.9）盖上盖混匀，置于振荡器上以300z/min原荡10min，在离心机中以10c09r/min高心5min，将上层溶液用滤纸过滤于鸡心瓶，残渣再用20mL提取液（4.9）超声提取10min，以10000r/min离心5miz，酱上层溶液用滤纸过滤，合并二次港液，于低于40℃条件下旋转蒸发至近干（药剩余2mL以下）利余液转移至1CmL其寒刻度离心管中，用甲醇（4.1)洗涤鸡心瓶，合并溶液并用甲醇（4.1)定容至5.0cmL，旋涡混匀1min然后加人5mL泡和了80%甲醇水的正已烧溶液（4.8），旋涡混1min，以3000r/min离心3min，弃去上层己烧层再加人5mL饱和了80%甲醇水的正已烧溶液（4.8)，旋涡混匀1imin，以3600r/mn离心3min，取下层溶液过c.2μm滤膜（4.14）,供液相色谱-串联质谱测定。7.2阴性样品提取液的备
取不含氮氨菲啶的阴性牛奶或者奶粉样品，按71步制备阴性样品提取液，用于配制复氨非基质标准工作溶液。
7.3测定条件
7.3.1液相色谱参考条件
液相色谱参考条件如下：
色谱柱，AequityUPLCMBEHCgl.7#m，10ommX.mm(内径）或相当者a
b桂温：35C
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进样量：5证：Www.bzxZ.net
流动相及流速见表工。
时间/min
7.3.2质谱参考条件
质谱参考条件如下
表1液相色谱梯度洗脱条件
蔬速/m/min)
离子源：电喷雾离子源（ESID：扫描方式正离子打描：
检测方式：多反应监测（MRM)：毛维管电压：100kV;
锥孔电压：31V
离手源温度：110℃：
脱溶剂温度：4000
脱溶剂气流量：45CL/五，
链孔气流量：50L/h；
批撞室压力10.415PA：
截撞气氩气：
水（含0.2%的甲酸）/%
氮氨菲啶是量离子对、性离子对及撞能量见表2。表2氨氨非啶定性离子对，定量离子对、碰撞能量及驻留时间定量商于对（m/）
460.4/258.5
定性高子对（m/z）
460.1/298.5
460.4/313.6
7.3.3液相色谱-串联质谱测
7.3.3.1定性测定
碰擅能量y
GB/T229742008
甲醇/%
Intial
驻留时闻/
在相同的实验条件下进行样品测定时，如果样品中待测物质的色谱蜂保留时间与标准品色谱峰保留时间相差在土2.5%以内且样品色谱图中定性离于的相对丰度与浓度相近的基质标准工作溶液色谱图中对应的定性离子的相对丰度进行比较，相对确差不超过表3规定的范围，则可判定样品中存在该种待测物。
表3定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度K
充许展大偏差
7.3.3.2定量测定
10KR20
在仪器最佳工作条件下，对复氢非啶基质标准工作溶液（4.13）进行色谱分析，以峰面积为纵垒标基质标准工作溶液浓度为横坐标绘制，用标准工作曲线对样品进行定量，基质标准工作溶液和样液中氮复菲啶的响应值均应在权器测定的线性范围内。在上述色谱和质谱条件下，氮复菲啶的参考保留时间3
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为2.7CTrin氨氨菲啶基质标准液的多反应监测（MRM）色谱图参觉附录A中的图A.1本方法的添加回收数据参见附录B中的表B.17.4平行试验
按上述步骤，对同一试样进行平行试验测定。7.5空白试验
除不称取试样外，均按上述分析步骤进行8结果计算
样品中氨氨菲啶残留昼的测定结果可自仪器工作站软件计算，也可按式（1）计算X=c≥x100×F
式中：
试样中被测组分残留量，单位为毫克每干克（mg/kg）：从标准工作曲线上得到的被测组分潜液浓度，单位为微克每毫升（/mL）；样品落液定容体积，单位为毫升（mL）：V
样品溶液所代表试样的质量，单位为克（）：换算系数，牛奶F-1，奶粉F-20。计算结果应扣除空白值
9精密度
9.1一般规定
本标准的精密度数据是按照GB/T6379.1和GB/T6379.2的规定确定的，其重复性和再现性的值是以95%的可信皮来计算，
9.2重复性
在重复性试验条件下，状得的两次独立测试结的绝对差值不超过重复性限（），试样中氮氨菲含量范围在0.c10mg/g~0.10mg/kg之间时，重复性方程：牛奶为1gy=1.1355Igm一0.8358，奶粉为1gr=1.09731gm-1.0027.
如果两次测定值的差值超过重复性限（），应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。9.3再现性
在再现性试验条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限（R），试样中氮氨菲啶含量范围在0.0101g/kg~0.10mg/kg之间时，重复性方程：牛奶为1gR=0.9995lgm-9.8159奶粉为1gR-0.89501gm-0.9878
注：并为两次测定结果的算术平均值ht
附录A
（资料性附录）
标准溶液的多反应监测(MRM)色谱图氮氨菲啶基质标准溶液的多反应监测（MRMD色谱图，见图A.I100%
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#205071001511520025252话43032515037400425450475508氛氨菲啶基质标准溶液的多反应监测MRMD色谱图图A.1
http：/
/wat.foodm
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附录B
（资料性附录）
回收率
氮氨非啶添加浓度及平均国收率的式验数据，见表B.1。表B.1氮氨非啶添加浓度及平均回收率的试验数据样品基质
奶粉复原乳
添加线度/（mg/kg）
品伙伴网h村
/wwtfoodm
平均回收率/%
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