本标准规定了牛奶和奶粉中卡巴氧代谢物喹噁啉-2-羧酸和喹乙醇代谢物3-甲基喹噁啉-2-羧酸残留量的液相色谱-串联质谱测定方法。本标准适用于牛奶和奶粉中卡巴氧代谢物喹噁啉-2-羧酸羧酸和喹乙醇代谢物3-甲基喹噁啉-2-羧酸残留量的测定。 GB/T 22984-2008 牛奶和奶粉中卡巴氧和喹乙醇代谢物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 GB/T22984-2008 标准下载解压密码：www.bzxz.net

ICS67.050
中华人民共和国国家标准
GB/T22984-—2008
牛奶和奶粉中卡巴氧和喹乙醇代谢物残留量的测定
液相色谱-串联质谱法
Determination of the residues of metabolites of carbadox andolaquindox in milk and milk powder-LC-MS-MSmethod
2008-12-31发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2009-05-01实施
本标准的附录A、附录B为资料性附录，前言
本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口。GB/T22984—2008
本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局
本标准主要起草人：林黎、谢丽琪、欧阳妍、梁宏、叶刚、廖菁菁、庞国芳I
1范围
牛奶和奶粉中卡巴氧和喹乙醇代谢物残留量的测定
液相色谱-串联质谱法
GB/T22984—2008
本标准规定了牛奶和奶粉中卡巴氧代谢物喹琳-2-羧酸（uinoxaline-2-carboxvlicacid）和喹乙醇代谢物3-甲基喹啉-2-羧酸（3-methylquinoxaline-2-carboxylicacid)残留量的液相色谱-串联质谱测定方法。
本标准适用于牛奶和奶粉中卡巴氧代谢物喹嗯啉-2-羧酸（quinoxaline-2-carboxylicacid）和喹乙醇代谢物3-甲基喹嗯啉-2-羧酸（3-methylquinoxaline-2-carboxylicacid）残留量的测定。本标准的方法检出限：喹嗯啉-2-羧酸和3-甲基喹啉-2-羧酸的方法检出限牛奶为0.5μg/kg，奶粉为4.0μg/kg。
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义(GB/T6379.1—2004,ISO5725-1:1994,IDT)GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法（GB/T6379.2--2004，ISO5725-2:1994,IDT)GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682—2008，ISO3696：1987，MOD）3原理
用甲酸溶液消化试样，使牛奶和奶粉中天然存在的酶失活，然后加人蛋白酶水解，盐酸酸化，离心过滤后，固相萃取柱净化，液相色谱-串联质谱仪测定，内标法定量。4试剂和材料
除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。4.1甲醇：色谱纯。
4.2甲酸：色谱纯。
4.3乙酸钠。
4.4乙酸乙酯。
4.52%甲酸-乙酸乙酯溶液：向400mL乙酸乙酯中加10mL甲酸，用乙酸乙酯定容至500mL。4.60.6%甲酸溶液：量取6.0mL甲酸，用水溶解、定容至1L。4.70.1%甲酸溶液：量取1.0mL甲酸，用水溶解、定容至1L。4.8甲酸-甲醇溶液（19+1）：用190mL甲酸溶液（4.2)与10mL甲醇（4.1）混合。4.90.1mol/L盐酸溶液：量取8.3mL浓盐酸，用水溶解、定容至1L。4.100.3mol/L盐酸溶液：量取25mL浓盐酸，用水溶解、定容至1L。1
GB/T22984—2008
4.11Protease蛋白酶：SigmaP5147或相当者，-18℃以下保存。4.120.01g/mL蛋白酶水溶液：称取1.00gProtease蛋白酶（4.11），用水溶解、定容至100mL，4℃保存。
4.1310%乙酸溶液：量取100mL乙酸，用水溶解、定容至1L。4.140.05mol/L乙酸钠溶液：称取6.8g乙酸钠用800mL水溶解，再滴加10%乙酸溶液以调节溶液pH=7,用水定容至1L。
4.15乙酸钠-甲醇溶液（19+1）：用190mL乙酸钠溶液（4.14）与10mL甲醇（4.1）混合。4.16甲醇-水溶液（1十4)。
4.17Tris碱：SigmaT1503或相当者。4.181,0mol/LTris溶液：称取121gTris碱（4.17），用水溶解、定容至1L，4℃保存。4.19喹嗯啉-2-羧酸、3-甲基喹嗯啉-2-羧酸、喹嗯啉-2-羧酸-d4标准物质：纯度≥99%。4.20标准储备液：100mg/L。准确称取适量标准物质，分别用甲醇溶解定容，配成100mg/L的标准储备液，在一18℃以下保存。
4.21基质混合标准工作溶液：根据灵敏度和使用需要，用空白样品提取液配成不同浓度（μg/L）的混合标准工作溶液，在4℃保存。
4.22内标工作溶液：准确称取适量喹嗯啉-2-羧酸-d4标准物质，用甲醇溶解定容，配成100μg/L的标准工作溶液，在4℃保存。
4.23OasisMAX固相萃取柱\或相当者：60mg，3mL。用前分别用3mL甲醇和3mL水活化，保持柱体湿润。
4.24滤膜：0.2μm。
5仪器和设备
5.1液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源。5.2固相萃取真空装置。
5.3吹氮浓缩仪。
5.4旋涡振荡器。
5.5分析天平：感量0.1mg和0.01g。5.6真空泵。
5.7低温离心机：可制冷到4℃，转速大于5000r/min。5.8移液器量程：10μL~100μL和100μL~1000μL。5.9聚丙烯离心管：15mL和50mL，具塞。5.10pH计：精度士0.02pH单位。6试样制备与保存
6.1试样的制备
取不少于500g有代表性的牛奶或奶粉，充分混匀，分为两份，置于样品瓶中，密封，并作上标记。6.2试样的保存
牛奶置于4℃冰柜中避光保存，奶粉则于室温下置于干燥器保存。1）OasisMAX固相萃取柱是Waters公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。2
7测定步骤
7.1提取
7.1.1牛奶
GB/T22984—2008
准确称取5g牛奶样品（精确到0.01g），置于50mL聚丙烯离心管中，加人一定量的内标溶液（4.22），使其浓度为2.0ng/g，再加人10mL0.6%甲酸溶液（4.6），混匀后，置于（47士3）℃振荡水浴中振摇1h；然后先加人3mL1.0mol/LTris溶液（4.18），再加入0.3mL蛋白酶水溶液（4.12），充分混匀后，置于（47土3）℃振荡水浴中酶解16h~18h。加人20mL0.3mol/L盐酸（4.10），振荡5min，在10℃以5000r/min离心15min，上清液过滤。7.1.2奶粉
取12.5g奶粉于烧杯中，加适量35℃～50℃水将其溶解，待冷却至室温后，加水至总质量为100g，充分混勾后准确称取5g样品（精确到0.01g），置于50mL聚丙烯离心管中，按7.1.1步骤进行处理。
7.2净化
将7.1所得溶液以约1mL/min的流速全部通过OasisMAX固相萃取柱（4.23），分别用15mL乙酸钠-甲醇溶液（4.15）淋洗固相萃取柱，真空抽干15min。再用5mL甲醇、3mL水，5mL0.1mol/L盐酸（4.9)和3mL甲醇-水溶液（4.16)分别淋洗，真空抽干15min，然后用2mL乙酸乙酯淋洗固相萃取柱，弃去全部淋出液，最后用3mL甲酸-乙酸乙酯溶液（4.5）洗脱喹嗯啉-2-羧酸和3-甲基喹喽嘛-2-羧酸，置于15mL聚丙烯离心管中，在45℃用氮气浓缩仪吹干。准确加人1.0mL甲酸-甲醇溶液（4.8）溶解残渣，过0.2um滤膜，供液相色谱-串联质谱仪测定。7.3空白基质溶液的制备
称取阴性样品5g（精确到0.01g），按7.1和7.2步骤操作。7.4测定条件
7.4.1液相色谱参考条件
液相色谱参考条件如下：
色谱柱：ODS,3μm100mmX2.1mm（内径）或相当者；a)
b）流动相：甲醇、乙腈以及0.1%甲酸溶液（时间梯度见表1)；表1流动相时间梯度
时间/min
流速：0.2mL/min;
d）柱温：30℃；
进样量：30μL。
7.4.2质谱参考条件
质谱参考条件如下：
a）离子源：电喷雾离子源；
b）扫描方式：正离子扫描；
c）检测方式：多反应检测；
甲醇/%
乙腈/%
0.1%甲酸/%
GB/T22984--2008
分辨率：单位质量分辨率；
电喷雾电压：5000V；
雾化气流速：8.0L/min；
气帘气流速：7.0L/min；
辅助气流速：5.0L/min；
离子源温度：450℃；
定性离子对、定量离子对及其他质谱参数见表2。i）
表2各种化合物的定性离子对、定量离子对、去簇电压、碰撞电压、碰撞池出口电压定性
化合物名称
喹喽啉-2-羧酸
3-甲基喹嗯啉-2-羧酸
离子对
175.0/129.2
175.0/131.2
189.2/143.1
189.2/145.1
7.4.3液相色谱-串联质谱测定
7.4.3.1定性测定
离子对
175.0/131.2
189.2/145.1
定量内标
离子对
179.2/133.2www.bzxz.net
179.2/133.2
电压/
电压/
电压/
碰撞池出口
电压/
每种被测组分选择1个母离子，2个以上子离子，在相同实验条件下，样品中待测物质的保留时间，与混合标准工作溶液中对应的保留时间偏差在土2.5%之内，各分析化合物的参考保留时间见表3，样品中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的混合标准工作溶液中对应的定性离子的相对丰度进行比较，若偏差不超过表4规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。表3分析化合物参考保留时间
化合物名称
唑嗯啉-2-羧酸
3-甲基喹嗯啉-2-羧酸
保留时间/min
表4定性确定时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度K
允许最大偏差
7.4.3.2定量测定
2010K≤10
用混合标准工作溶液（4.21)分别进样，以分析化合物和内标化合物的峰面积比为纵坐标，以分析化合物和内标化合物的浓度比为横坐标作标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中喹嗯啉-2-羧酸和3-甲基喹嗯啉-2-羧酸的响应值均应在仪器测定的线性范围内。唑嗯啉-2-羧酸和3-甲基喹嗯啉-2-羧酸标准物质提取离子流图参见附录A中的图A.1和图A,2。7.5平行试验
按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。7.6回收率试验
阴性样品中添加标准溶液，按步骤7.1.17.1.3操作，测定后计算样品添加的回收率。本方法中喹嗯啉-2-羧酸和3-甲基喹嗯啉-2-羧酸在两种基质中的添加浓度及其平均回收率的试验数据参见附录 B 中的表 B.1。
8结果计算
试样中每种化合物残留量按式(1)计算：xx
Asxcst
式中：
试样中被测物残留量，单位为微克每千克（μg/kg）；1000
基质标准工作溶液中被测物的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL)；试样溶液中被测物的色谱峰面积；基质标准工作溶液中被测物的色谱峰面积；试样溶液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；基质标准工作溶液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL)；基质标准工作溶液中内标物的色谱峰面积；试样溶液中内标物的色谱峰面积；样液最终定容体积，单位为毫升（mL）；试样溶液所代表试样的质量，单位为克（）。计算结果应扣除空白值。
9精密度
9.1一般规定
GB/T22984-—2008
·（1）
本方法的精密度数据是按照GB/T6379.1和GB/T6379.2的规定确定的，重复性和再现性的值以95%的可信度来计算。
9.2重复性
在重复性实验条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限T，样品中两种分析化合物的添加浓度范围及重复性方程见表5。表5添加浓度范围及重复性和再现性方程化合物名称
唑嗯啉-2-羧酸
3-甲基喹嗯啉-2-羧酸
样品基质添加浓度范围
注：m为两次测定结果的算术平均值。重复性限r
单位为毫克每千克
再现性限R
lgr=0.8797lgm-1.0179
1gR=0.8445lgm-0.6489
lgr=0.9561lgm-1.0554
IgR=0.7578lgm-0.6163
lgr=0.8697lgm-1.077 2
gr0.9821lgm-0.9851
lgR=0.7240lgm-0.6492
IgR-0.8600lgm-0.5997
如果差值超过重复性限，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。9.3再现性
在再现性实验条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R，样品中两种分析化合物的添加浓度范围及再现性方程见表5。5
GB/T22984—2008
附录A
（资料性附录）
标准物质提取离子流图
喹喂啉-2-羧酸（QCA)和同位素内标(QCA-d4)标准物质提取离子流图，见图A.1；3-甲基喹嗯啉-2-羧酸（MQCA)和同位素内标（QCA-d4)标准物质提取离子流图，见图A.2。10.19
20001.932:24:85.69 7.670
0.112,646.10
2.07/4.38
17.74、18.51
QCA-d4
4 0000.992.01
13.5215.410
13.556.427.69
QCA-d4
681012141618
喹曬啉-2-羧酸(QCA)和同位素内标（QCA-d4)标准物质提取离子流图11.11
6.497.7610.35
16.5018.92
hetosnd
QCA-d4
00.992.01
352415222
3.556.421.8
QCA-d4
4 0000.992,01
413,5215.4116.5218.22
3.556.426.69
daad aky
681012141618
图A.23-甲基喹嗯啉-2-羧酸（MOCA）和同位素内标（QCA-d4）标准物质提取离子流图附录B
（资料性附录）
回收率
GB/T22984—2008
本方法中喹嗯啉-2-羧酸和3-甲基喹嗯啉-2-羧酸在牛奶和奶粉中添加浓度及其平均回收率的试验数据，见表B.1。
喹嗯啉-2-羧酸和3-甲基喹啉-2-羧酸在牛奶和奶粉中添加浓度及其平均回收率的试验数据化合物名称
喹嗯啉-2-羧酸
3-甲基喹嗯啉-2-羧酸
样品基质
添加浓度/（μg/kg）
平均回收率/%
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