本标准规定了牛奶和奶粉中头孢匹林、头孢氨苄、头孢洛宁、头孢喹肟残留量的液相色谱?串联质谱测定方法。本标准适用于牛奶和奶粉中头孢匹林、头孢氨苄、头孢洛宁、头孢喹肟残留量的测定。 GB/T 22989-2008 牛奶和奶粉中头孢匹林、头孢氨苄、头孢洛宁、头孢喹肟残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 GB/T22989-2008 标准下载解压密码：www.bzxz.net

ICS 67. 050
中华人民共和国国家标准
GB/T22989---2008
牛奶和奶粉中头孢匹林、头孢氨菜、头孢洛宁、头孢喹残留量的测定液相色谱-串联质谱法
Determination of cefapirin , cephalexin , cefalonium, cefquinomeresidues in milk and milk powder--LC-MS-MS method
2008-12-31发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2009-05-01实施
本标准的附录A、附录B为资料性附录。本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口，本标准起草单位；中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局。本标谁主要起草人：李学民、母健、曹彦忠、刘晓茂、钱小清、庞国芳。GB/T22989—200B
1范围
牛奶和奶粉中头孢匹林、头孢氨苄、头孢洛宁、头孢喹肟残留量的测定液相色谱-串联质谱法
GB/T 229892008
本标准规定了牛奶和奶粉中头孢匹林、头孢氢节、头孢洛宁、头孢喹残留量的液相色谱-串联质谱测定方法。
木标准适用于牛奶和奶粉中头孢匹林、头孢氨芊、头孢格守，头孢喹肟残留量的测定，本标准牛奶的方法检出限：头孢匹林，头孢氨苯、头孢洛宁、头孢喹为4.口名/kg；奶粉的方法检出限为：头孢匹林、头孢氮苄、头孢洛宁、头孢喹肟为32g/kg。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6379.1：测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义(GB/T6379.12004.ISO5725-1:1994,IDT)GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法（GB/T6379.2—2004,ISO5725-2：1994,IDT)CB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682—2008，ISO3696：1987MOD）3原理
试样中四种头孢菌素类药物残留，用乙睛、磷酸盐缓冲溶液提取，固相萃取柱净化，液相色谱-串联质谱仪测定,外标法定量。
4试剂和材料
除另有说明外，所用试剂均为分析纯。4.1水:GB/T 6682,--级。
4.2中醇:色谱纯。
4.3乙睛：色谱纯。
4.4磷酸二氢钠4.5氢氧化钠：优级纯。
4.6乙酸。
4.7正已烷。
4.8乙晴-水溶液（3十1）：量取60mL乙（4.3）和20mL水充分混合。4.9乙饱和的正已烷：取1.00mL正已烷（4.7)和50mL乙于250ml.分液漏斗中，振摇1min，静置分层后，弃掉乙腈。
4.105mol/L氢氧化钠溶液：称收20g氢氧化钠（4.5),用水溶解，定容至100mL。4.110.10mol/L磷酸二氢钠缓冲溶液：称取12.0g磷酸二氢钠（4.1)，用水溶解，定容至1000ml.1
GB/T 22989--2008
然后用氢氧化钠溶液（4.10)调节至pH8.5。4.12标准物质：头孢匹林（CAS24356-60-3）头孢氟华（CAS：16549-56-7）、头孢宁（CAS：5575-21-3），头孢唑肟（CAS：118443-89-3)，纯度大于等于99%。4.131.0mg/mL四种头孢菌素标准储备溶液：准确称取适量的每种标准物质（1.12),分别用水配制成浓度为 1.0 mg/mL的标准储备溶液。储备液贮存在一18C冰柜中。4.14四种头孢菌素标准混合T作溶液：根据需要吸取适量的每种头孢菌素标准储备溶液（4.13）,用水制成适当浓度的混合标准工作溶液。4.15OasisHLB固相萃取柱或相当者500 tmg,6 mL：使用前依次用5 mL甲醇（4.2)、5 mL水和10mL磷酸二氢钠缓冲溶液(4.11)预处理，保持柱体湿润。4.15滤膜：0.2μm。
5仪器
5.1相色谱-串联四极杆质谱仪，配有电喷雾离子源。5.2分析天平：感量0.1mg、0.01g。5.3固相萃取真空装置。
5.4贮液器：50ml.。
5.5微量注射器：25μL,100μ。5.6均质器
高速冷冻离心机：带有50mL具塞离心管，转速达到10000/min以[:。5.7
5.8刻度样品管;5 mL,精度为0.1 mL。5.9旋转浓缩仪。
5.10氮气浓缩仪。
6试样制备与保存
6.1试样的制备
从全部样品中取出有代表性样品约1kg，充分混匀，均分成两份，分别装人洁净容器内。密封后作为试样，标明标记。在抽样和样的操作过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。6.2试样的保存
将试样于一18 ℃保存。
7测定步骤
7.1试样溶液的提取
7.1.1牛奶
称取 5 g试样(精确到 0. 01 g)置于 50 mL 离心管中,灿入 20 mL 乙睛(4. 3),使用与质器(5. 6)均质1min，提取液使用高速冷陈离心机(5.7)在10℃C 10000 r/min离心10 min,把上层提取液移至另离心管中。用15 mL乙-水溶液(4.8)重复提取一-次，合并两次的提取液,并加人 10 mL 乙腈饱和的正已烷（4.9），振荡1min，弃掉正已烷。把提取液移至100mL鸡心瓶中，在40℃用旋转浓缩仪（5.9）旋转蒸发除去乙晴。
7.1,2奶粉
称取 0.5g试样（精确到0.01g)置于50ⅡL离心管中,加入4.0 mI.水，使奶粉充分溶解，加人1）Oasis HLB固相萃取柱是Waters 公司产品的商品名称，给出这--信.息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认可。如果其他产品其有相同的效巢，购可使用这些等效产品。2
GB/T 22989--2008
20mL乙睛（4.3),使用均质器(5.6)均质1min,提取液使用高速冷冻离心机(5.7)在10℃10000//min离心10nin，把上层提取液移至另一-离心管中，用15mL乙脂-水溶液（4.8）重复提取一次，合并两次的提取液，并加人10mL乙睛饱和的正己烷（4.9），振荡1min，弃掉正已烷。把提取液移至100mL鸡心瓶中,在 40 ℃用旋转浓缩仪(5.9)旋转蒸发除去乙腈。7.2试样溶液的净化
向已除去乙腈的样品溶液中加入20mI.磷酸二氢钠缓冲溶液，然后用氢氧化钠溶液（4.10）调节至pH一8.5，把样品提取液移至下接OasisHLB固相萃取柱（4.15）的贮液器中，以3mL./min的流速通过固相萃取栏，先用5mL磷二氧钠缓冲溶液洗涤鸡心瓶并过柱，再用2mL水洗柱，弃去全部流出液。用2mL乙睛洗脱，收集洗脱液于刻度样品管（5.8)中，在40℃氮气浓缩仪（5.10)吹干，用2mL水溶解残渣，摇勾后,过0.2 um滤膜(4.16),供液相色谱-申联质谱仪测定。7.3空白样品添加标准混合工作溶液的制备7.3. 1牛奶
分别准确移取适量四种头孢菌素标准混合工作溶液（4.14），添加到5.0g样品中，按照7.1.7.2步骤操作，制得头孢匹林、头孢氨苄、头抱洛宁、头孢喹浓度分别为4.0μg/kg、8.0μg/kg、16μg/kg、40μg/kg四个样品添加标准混合工作溶液，供液相色谱-申联质谱仪测定。7.3.2奶粉
分别准确移取适量四种头孢菌素标准混合工作溶液（4.14），添加到0.5样品中，按照7.1、7.2步操作,制得头孢匹林、头孢氨苄、头孢宁、头孢喹聘浓度分别为 32 产g/kg、64 μg/kg、128 μg/kg、320μg/kg四个样品添加标准混合工作溶液，供液相色谱-串联质谱仪测定。7.4测定条件
7.4.1液相色谱参考条件
液相色谱参考条件如下：
色谱柱：ZORBAXSB-Cs，3.5μm，150mm×2.1mm（内径）或相当者；a)
b）流动相组成、流速及梯度程序见表1；c)
样温：30C：
d）进样量：20μL。
表1流动相梯度程序及流速
时间/min
7.4. 2质谱参考条件
质谱参考条件如下：
流速/(μL/min)
a）离子源电喷筹离子源；
b）扫描方式：正离子扫描；
检测方式：多反应监测；
电喷雾电压：5500V；
雾化气压力：0.055MPa；
水（含0.1%乙酸）/%
乙腈/%
GB/T 22989—2008
f）气帘气压力：0.079MPa；
g）辅助气流速：6L/tmin;
h）离子源温度：100℃
i）定性离子对、定量离子对和去簇电压(DP)、碰撞气能量(CE)见表2。表2四种头孢菌紊的定性离子对、定量离子对、去簇电压、碰撞气能量中文名称Www.bzxZ.net
头孢匹林
头孢氨苄
头孢落守
头孢喹肘
英文名称
celupirin
cephalexin
cefalonium
cclquinomc
7.4.3液相色谱-串联质谱测定
7. 4. 3. 1 定性测定
定性离子对(m/z)
424/292
424/152
348/158
348/174
459/152
459/123
529/134
529/396
定量离子对(m/z)
424/292
318/158
459/152
529/134
碰撞气能避/V
去簇电压/V
选择衔种待测物质的·个母离子，二个以上了离子，在相同实验条件下，样品中待测物质的保留时间，与基质标准溶液中对应物质的保留时间偏差在土2.5%之内；样品谱图中各定性离子相对丰度与浓度接近的基质标推溶液的谱图中离子相对丰度相比，偏差不超过表3规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。
表3定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度(K)
允许的最大偏差
7.4.3.2定量测定
20K<50
用7.3制备的基质标准混合工作溶液分别进样，以标准工作溶液浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线。用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中四种头孢菌素的喇应值均应在仪器测定的线性范围内。在上述色谱条件下，四种头孢菌素标准物质的多反应监测（MRM）色谱图参见附录 A中的图 A. 1。
本方法的添加回收率数据参见附录 B中的表 B. 1。7.5平行试验
按上述步骤,对同一试样进行乎行试验测定。7. 6 空白试验
除不称取试样外，均按上述分析步骤进行。8结果计算
试样中四种头孢菌素残留量利用数据处理系统计算或按式(1)计算：Xc××1000
式中：
X-试样中被测组分残留量,单位为微克每下克(μg/kg)；一从标准工作曲线得到的试样溶液中被测组分的浓度，单位为纳克每毫升（rng/mL）；(1)
V——试样溶液定容体积，单位为毫升(mL);一最终试样溶液所代表的试样质量，单位为克（g）：计算结果应扣除空白值。
9精密度
9. 1 一般规定
GB/T 22989—2008
本标准的精密度数据是按照G3/T6379.1和GB/T6379.2规定确定的，其重复性和再现性的值是以95%的可信度来计算。
9.2重复性
在重复性试验条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r，试样中四种头孢菌素添加铱度范围及重复性方程见表4。表4四种头孢菌素添加浓度范围及重复性限和再现性限方程单位为微克每千克化合物名称
头孢匹林
头孢氯芋
头孢洛宁
头孢噬
添加浓度范围
4,0~200
4,0~200
注：m 为两次测定结果的算术平均值。重复性限，
Ig r=1. 058 9 lg m-1. 174 8
Ig r= 1. 061 4 lg m-1. 177 4Ig r=1. 060 lg m-1. 177 1
Ig r=1. 065 3 Ig m-1. 188 7
再现性限R
Ig R=1. 021 8 lg m-0. 694 5
Ig R=1. 027 0 lg m— 0. 702 0lg R=1. 023 7 lg m—0. 697 1Ig R=1. 024 1 lg m-0. 698 5
如果两次测定值的差值超过重复性限，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定9.3再现性
在再现性试验条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R，试样中四种头孢菌素添加浓度范围及重复性方程见表4。GB/T22989—2008
附录A
(资料性附录)
标准物质的多反应监测(MRM)色谱图四种头孢菌素标准物质的多反应监测（MRM)色谱图，见图A.1。8.02
sdasustrau
sdaykisuau
sday.sisura
头孢匹林
头孢氮竿
头弛洛宁
头孢唑肪
四种头孢菌素标准物质的多反应监测(MRM)色谱图t/man
t/mins
附录B
（资料性附录）
回收率
四种头孢菌素添加浓度及其平均回收率的试验数据，见表B.1。表B.1四种头孢菌索添加浓度及其平均回收率的试验数据化合物名称
头孢匹林
头孢氨卡
头孢溶宁
头孢肟
添加浓度/(ug/kg）
平均回收率/%
加浓度/（μg/kg）
GB/T22989—2008
平均回收率/%
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