本标准规定了牛奶和奶粉中乙酰丙嗪、氯丙嗪、氟哌啶醇、丙酰二甲氨基丙吩噻嗪、甲苯噻嗪、阿扎哌隆及其代谢物阿扎哌醇(ａｚａｐｅｒｏｌ)和β?阻断剂咔唑心安(ｃａｒａｚｏｌｏｌ)残留量的液相色谱?串联质谱测定方法。本标准适用于牛奶和奶粉中乙酰丙嗪、氯丙嗪、氟哌啶醇、丙酰二甲氨基丙吩噻嗪、甲苯噻嗪、阿扎哌隆、阿扎哌醇、咔唑心安残留量的测定。 GB/T 22993-2008 牛奶和奶粉中八种镇定剂残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 GB/T22993-2008 标准下载解压密码：www.bzxz.net

ICS67.050
中华人民共和国国家标准
GB/T22993—2008
牛奶和奶粉中八种镇定剂残留量的测定液相色谱-串联质谱法
Determination of eight tranquillizers residuesinbovinemilkandmilkpowder
LC-MS-MSmethod
2008-12-31发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2009-05-01实施
本标准的附录A、附录B为资料性附录，前言
本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口。GB/T22993-2008
本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局、中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局。
本标准主要起草人：宋文斌、李一尘、李军、隋凯、董振霖、李百、王旭、赵守成、庞国芳。I
1范围
牛奶和奶粉中八种镇定剂残留量的测定液相色谱-串联质谱法
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本标准规定了牛奶和奶粉中乙酰丙嗪（cetopromaizine）、氯丙嗪（chlorpromazin）、氟哌啶醇（halo-peridol)、丙酰二甲氨基丙吩噻嗪（propionylpromazine），甲苯噻嗪（xylazine）、阿扎哌隆（azaperone）及其代谢物阿扎哌醇（azaperol)和β-阻断剂咔唑心安（carazolol）残留量的液相色谱-串联质谱测定方法。本标准适用于牛奶和奶粉中乙酰丙嗪、氯丙嗪、氟哌啶醇、丙酰二甲氨基丙吩噻嗪、甲苯噻嗪、阿扎哌隆、阿扎哌醇、咔唑心安残留量的测定。本标准方法检出限：牛奶中乙酰丙嗪、氯丙嗪、丙酰二甲氨基丙吩噻嗪、味唑心安均为0.5μg/L，甲苯噻嗪为0.25μg/L，阿扎哌隆为0.2μg/L，阿扎哌醇为0.15μg/L，氟哌啶醇为0.1μg/L，奶粉中乙酰丙嗪、氯丙嗪、丙酰二甲氨基丙吩噻嗪、咔唑心安均为4.0pg/kg，甲苯噻嗪为2.0μg/kg，阿扎哌隆为1.6μg/kg，阿扎哌醇为1.2μg/kg，氟哌啶醇为0.8μg/kg。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准。然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义(GB/T6379.1—2004,ISO5725-1:1994,IDT)GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法（GB/T6379.2—2004，ISO5725-2：1994，IDT）GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682—2008ISO3696：1987，MOD）3原理
样品在碱性条件下用特丁基甲醚提取，提取液用磷酸盐缓冲液调成酸性，弃去有机相，水相再调成碱性用特丁基甲醚净反萃后浓缩定容，进行液相色谱-串联质谱仪测定，外标法定量。4试剂和材料
除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。4.1乙腈：色谱纯。
4.2甲醇：色谱纯。
4.3无水乙醇：色谱纯。
4.4盐酸：优级纯。
4.5特丁基甲醚。
4.6氢氧化钠。
4.7氢氧化钠溶液：5mol/L。称取50.0g氢氧化钠（4.6)用水溶解，定容到250mL。4.8磷酸二氢钾。
4.9磷酸二氢钾溶液：1mol/L，pH=3.0称取68.045g磷酸二氢钾（4.8）用水溶解，用盐酸（4.4)将1
GB/T22993—2008
溶液的pH值调至3.0，定容到500mL。4.10甲酸铵。
4.11甲酸：色谱纯。
4.12甲酸铵缓冲液：0.1mol/L，pH=4.0，称取6.306g甲酸铵（4.10）用水溶解，用甲酸（4.11）将pH值调至4.0,定容至1000mL。
4.13甲酸铵缓冲液：0.01mol/L，pH=4.0，取甲酸铵缓冲液（4.12）100mL用水稀释定容到1000mL
4.14流动相A：0.01mol/L甲酸铵缓冲液，pH=4.0(4.13)，通过0.2μm过滤器过滤。流动相B：乙睛（4.1)通过0.2μm过滤器过滤。4.15
4.16流动相C.甲醇（4.2)通过0.2μm过滤器过滤。4.17混合流动相：将70mL流动相A，15mL流动相B以及15mL流动相C混合。4.18镇定剂及其代谢物和β-阻断剂的标准物质：乙酰丙嗪·马来酸，纯度大于等于99%；阿扎哌隆，纯度大于等于99%；咔唑心安，纯度：99%；氯丙嗪·盐酸，纯度：99%；氟哌啶醇，纯度大于等于99%；丙酰二甲氨基丙盼噻嗪·盐酸，纯度：98%；甲苯噻嗪·盐酸，纯度：99%；阿扎哌醇，浓度10.0μg/ml（甲醇）。
4.19八种镇定剂标准储备溶液
4.19.1乙酰丙嗪、阿扎哌隆、味唑心安、氯丙嗪、氟哌啶醇、丙酰二甲氨基丙吩噻嗪、甲苯噻嗪标准储备溶液：0.10mg/mL。称取适量的上述标准物质（4.18），分别用无水乙醇（4.3），配成0.10mg/mL的标准储备液。储备液避光在2℃～4℃条件下贮存。每年配制一次。4.19.2阿扎哌醇标准储备溶液：1.0μg/mL。准确移取1.0mL阿扎哌醇标准液（4.18）于10mL容量瓶中，用无水乙醇（4.3）定容至刻度，混匀，配成1.0μg/mL的标准储备液。储备液避光在2℃～4℃条件下贮存。每年配制一次。
4.20八种镇定剂混合标准储备溶液：量取适量的6种镇定剂及其代谢物标准储备溶液（4.19.1和4.19.2），用乙腈配制成混合标准储备溶液。在2℃～4℃条件下贮存。4.21八种镇定剂混合标准工作溶液：根据每种镇定剂及其代谢物的灵敏度和仪器线性范围用空白样品提取液配成不同浓度的混合标准工作溶液。在2℃～4℃条件下避光贮存。注：称取标准物的质量是按纯度和含盐量修正过的质量。5仪器
5.1液相色谱-串联四极杆质谱仪：配有电喷雾的离子源。5.2电子天平：感量0.1mg和0.1g。5.3离心机：最大转速为10000r/min。5.4离心管：锥形底玻璃离心管，15mL和10mL具塞；锥形底聚丙烯离心管，50mL，具螺旋盖。5.5过滤器：聚四氟乙烯过滤器，0.2μm×13mm；尼龙薄膜过滤器，0.2μm×47mm。5.6液体分配器：1mL~10mL和5mL~50mL。5.7微量移吸器：10μL~100μ和100μL~1000μL。5.8流动相过滤装置。
5.9氮气浓缩仪。
5.10高速涡流混合器。
振荡器。
2一次性移液管。
酸度计：测量精度为士0.02。
超声波仪。
5一次性注射器：1mL。
5.16试样瓶：2.0mL。
6试样的制备与保存
6.1试样的制备
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将牛奶和奶粉样品分别混合均匀。各自分出0.5kg作为试样，将分出的试样密封，并作上标记。6.2试样保存
将试样置于4℃条件下贮存。
7测定步骤
7.1提取
7.1.1牛奶样品
称取牛奶试样2.00mL精确到0.01mL，放人50mL聚丙烯离心管中，加入200μL乙睛进行涡流混合，混合后加入400uL5mol/L氢氧化钠溶液，并进行涡流混合30s。在80℃士5℃水浴中放置1h。在此期间，要对每个测定样品进行两次涡流混合。1h后，将样品从水浴中取出并冷却至室温。加人12mL特丁基甲醚，置于振荡器上高速振荡15min，离心15min（转速为5000r/min）。吸出上清液，将特丁基甲醛定量转移到干净的15mL的玻璃离心管内，待净化。7.1.2奶粉样品
称取奶粉样品0.25g（精确到0.01g），放人50mL聚丙烯离心管中，加入1.75g水超声溶解得到复原乳，加人200μL乙睛，以下步骤同7.1.1。7.2净化
在上述15mL离心管中加人1mol/L磷酸二氢钾溶液（pH=3.0)3mL，振荡10min，离心10min(5000r/min）。将特丁基甲醚层吸出弃去。在磷酸盐溶液中加入2mL特丁基甲醚，振荡5min，离心5min(5000r/min），吸出特丁基甲醚层弃去。然后再在磷酸盐缓冲溶液中加入2mL特丁基甲醚重复上述步骤。加入1mL5mol/L氢氧化钠溶液摇匀后加人10mL特丁基甲醚，振荡15min，离心5min（5000r/min）。定量吸取特丁基甲醚转移到一个干净的10mL的离心管中。在40℃条件下用氮吹仪蒸发至干。在浓缩至干的提取物中加人1000μL流动相溶液（4.17），进行涡流混合，超声处理10min。用0.2μm×13mm的聚四氟乙烯注射式过滤器过滤样液，将样液转移到试样瓶中，供液相色谱-串联质谱测定。
7.3色谱测定
7.3.1液相色谱参考条件
液相色谱参考条件如下：
a）色谱柱：InertsilODS-3，5μm，150mm×2.1mm（内径）或相当者；b)
柱温：35℃；
进样量：20μL；
d）色谱柱总流量：200μL/min；e)
流动相及梯度见表1。
表1流动相及梯度
运行时间/min
流动相A/%
流动相B/%
流动相C/%
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运行时间/min
质谱参考条件
质谱参考条件如下：
离子源：电喷雾离子源；
扫描方式：正离子扫描；
表1（续）
流动相A/%
检测方式：多反应检测（MRM)；电喷雾电压（IS)：5000V
雾化气压力(CAS1）：482.6kPa；气帘气压力（CUR）：68.9kPa；辅助气压力（CAS2)：482.6kPa；离子源温度（TEM)：700℃；
接口加热（ihe）：ON；
流动相B/%
流动相C/%
定性离子对、定量离子对、采集时间（DWell)、去簇电压（DP）、碰撞气能量（CE）、人口电压（EP）及碰撞室出口电压（CXP）见表2。表2八种镇定剂的质谱参数
化合物名称
乙酰丙嗪
acetopromaizine
氯丙嗪
chlorpromazine
氟哌啶醇
haloperidol
丙酰三甲氨
propionylpromazine
甲苯噻嗪
xylazine
阿扎哌隆
azaperone
阿扎哌醇
azaperol
咔唑心安
carazolol
定性离子对
327.40/58.20
327.40/86.20
319.30/58.20
319.30/86.20
376.40/165.40
376.40/122.90
341.20/58.20
341.20/86.30
221.30/90.10
221.30/164.40
328.40/121.00
328.4/147.10
330.30/121.00
330.30/149.10
330.30/312.20
299.50/116.20
299.50/222.40
定量离子对
327.40/58.20
327.40/86.20
319.30/58.20
319.30/86.20
376.40/165.40
376.40/122.90
341.20/58.20
341.20/86.30
221.30/90.10
221.30/164.40
328.40/121.00
328.4/147.10
330.30/121.00
330.30/149.10
330.30/312.20
299.50/116.20
299.50/222.40
采集时间/
去簇电压/
碰撞气
能量/V
入口电压小
出口电压/
7.3.3液相色谱-串联质谱测定
7.3.3.1定性测定
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按照液相色谱-串联质谱测定条件进行样品溶液测定。如果检出的色谱峰的保留时间与基质标准中物质相一致，并且所选择的离子均出现，选择1个母离子和2个以上子离子，样品谱图中定性离子的相对丰度与浓度接近的基质标准溶液谱图中对应的定性离子的相对丰度进行比较，偏差不超过表3规定要的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。表3定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度K
允许的最大偏差
7.3.3.2定量测定
2010K≤10
用混合标准溶液（4.21)分别进样，以峰面积为纵坐标，工作溶液浓度为横坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中镇定剂及其代谢产物和β-阻断剂的响应值均应在仪器测定的线性范围内。在上述的色谱条件和质谱条件下，八种镇定剂的参考保留时间见表4。八种镇定剂的标准物质总离子流图参见附录A中的图A.1。八种镇定剂的添加浓度及其平均回收率的试验数据参见附录B中的表B.1、表B.2。
表4八种镇定剂参考保留时间
化合物名称
甲苯噻嗪
阿扎哌醇
味唑心安
阿扎哌隆
7.4平行试验
保留时间/min
按照以上步骤，对同一试样进行平行试验。7.5回收率试验
除不称取试样外，均按上述步骤进行。8结果计算
化合物名称
氟哌啶醇
乙酰丙嗪
丙酰二甲氨基丙吩噻嗪
氮丙嗪
保留时间/min
试样中每种镇定剂及其代谢物和β-阻断剂残留量利用数据处理系统计算或按式(1)计算：V
×1000
式中：
试样中被测组分残留量，单位为微克每于克（ug/kg）c——从标准曲线上得到被测组分溶液的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL)；V样品溶液定容体积，单位为毫升（mL)；一样品溶液所代表试样的质量，单位为克（g）。m
计算结果应扣除空白值。
9精密度
9.1一般规定
（1）
本标准的精密度数据是按照GB/T6379.1和GB/T6379.2的规定确定的，其重复性限和再现性限的值是以95%的可信度来计算。5
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重复性
在重复性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限工，牛奶和奶粉中六种镇定剂及其代谢物的添加浓度范围及重复性方程见表5。表5牛奶和奶粉中八种镇定剂的添加浓度范围及重复性限和再现性限方程
化合物名称
乙酰丙嗪
氯丙嗪
氟哌啶醇
丙酰二甲氨基丙噻嗪
甲苯噬嗪
阿扎哌隆
阿扎哌醇
味唑心安
添加浓度范围
0.50~4.00
0.50~4.00
0.10~0.80
0.50~4.00
0.25~2.00
0.15~1.20
0.50~4.00
注：m为两次测定结果的算术平均值。重复性限r
lg r=0.749 Ig m-1.113
Igr=0.5971lgm-1.0663
单位为微克每千克
再现性限R
IgR=0.662lgm+0.436
IgR=0.7682lgm+0.4355
lgr=0.97153lgm-1.39365lgR=0.92256lgm+0.44711lgr=1.0188lgm1.4323
lgr=2.4448-3.9187lgm
lgr=0.6706lgm0.1095
lgr=1.03479lgm-1.0999
lgrm0.3726lgm-0.6302
lgR=1.5916lgm+2.2075
lgR=3.4365+6.0859lgm
IgR=0.6997lgm+0,3546
lg R=1. 106 lg m-2. 131 2
lgR=0.4622lgm+0.4401
如果差值超过重复性限r，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。9.3再现性
在再现性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R，牛奶和奶粉中六种镇定剂及其代谢物的添加浓度范围及再现性方程见表5。6
附录A
（资料性附录）
标准物质总离子流图
八种镇定剂标准物质总离子流图，见图A.19.2e5
甲苯噻嗪5.12min，阿扎哌醇9.21min，咔唑心安11.38min，
阿扎哌降13.01min，氟哌啶醇15.90min，乙酰丙嗪16.56min，
丙酰二甲氨基丙吩噻嗪18.84min，氯丙嗪19.74min图A.1八种镇定剂标准物质总离子流图GB/T22993—2008
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附录B
（资料性附录）
回收率
八种镇定剂添加浓度及其平均试验数据，见表B.1、表B.2。表B.1牛奶中八种镇定剂添加浓度及其平均试验数据化合物名称
乙酰丙嗪
氯丙嗪
氮哌啶醇
丙酰二甲氨基丙吩噻嗪
甲苯噬嗪
阿扎哌隆
阿扎哌醇
味唑心安
添加浓度/（μg/L）
平均回收率/%
化合物名称
乙酰丙嗪
氯丙嗪
氟哌啶醇
丙酰二甲氨基丙吩噻嗪
甲苯噻嗪
阿扎哌隆
阿扎哌醇
味唑心安
奶粉中八种镇定剂添加浓度及其平均回收率试验数据添加浓度/(μg/kg）
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平均回收率/%
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