本标准规定了新城疫的临床诊断、病毒分离与鉴定、血凝试验、血凝抑制试验、反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和综合判定。本标准适用于新城疫的诊断。 GB/T 16550-2008 新城疫诊断技术 GB/T16550-2008 标准下载解压密码：www.bzxz.net

ICS 11. 220
中华人民共和国国家标准
GB/T16550--2008
代替GB165501996
新城疫诊断技术
Diagnostic techniques for newcastle disease2008-12-31发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2009-05-01实施
GB/T 16550—2008
本标准对应于Ⅲ界动物卫生组织（OIE>《陆生动物卫生法典》（2006版）2.7.13“新城疫”和《陆生动物诊断试验和疫苗于册（哺乳动物、含鸟与蜜蜂）（2006版>2.1.15“新城疫”，具与该章节的一致性程度为非等效。
本标准代替GB16550--1996《新城疫检疫技术规范》。本标准与GB165501996相比主要变化如下：对标准名称进行了修订，修改为《新城疫诊断技术》；删除了原标准中属于行政执法行为的内容；对凝和血凝抑制试验进行了修改；增加了脑内接种致病指数(ICPI)、静脉接神效病指数（IVPT)-增加了RT-PCR检測方法。
本标准的附录A,附录B和附录C均为资料性附录。本标准山中华人民共和国农业部提出，本标雅由全国动物检疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归口，本标准起草单位：中国动物卫生与流行病学中心、扬州大学。本标准主要起草人：刘华雷、吴艳涛、王志亮，刘文博、马洪超、刘秀梵。本标确所代替标准的历次版本发布情况为：GB 16550—1996.
新城疫诊断技术
GB/T 16550—2008
本标准规定了新城疫的临床诊断、病毒分离与鉴定、血凝试验、凝抑制试验、反转录聚合酶链式反应（RT-PCR>和综合判定，
本标准适用于新城疫的诊断。
缩略语
下列缩略语适用于本标准。
临床诊断
焦碳酸二乙酯：
血凝单位，以完全凝集病葬的血清最高稀释倍数为一个血凝单位；血凝抑制；
脑内接种致病指数；
静脉按种致病指数；
致死鸡胚平均死心时间
新城疫病毒；
无特定病原体。
脑床症状
当食出现以下部分或全部情形时，可作为初步诊断的侬挪之a）.发病急，死亡率高；
b）体温升高，极度精神沉都，呼吸困难，食欲下降：C），粪便稀薄，黄缘色或黄白色，d）出现扭颈、翅膀麻痹等补经症状；e
免疫禽样出现产蛋下降。
病理变化
当禽出现下列肉眼可见的病变时，可作为初步诊断定性的依据之a
全身黏膜和浆膜出血，以呼吸道和消化道最为严重；腺胃黏膜水肿，乳头和乳头间有出血点：育肠桃体肿人、出耻，坏死；
十二指肠和直肠黏膜出血，有的可见纤维素性坏死病变脑膜充血和出血，道，喉，气管黏膜充血、偶有出血，肺可见证和水肝。e
当离出现工述病变时，应进行实验案确诊。4·病毒分离与鉴定
4.1：病毒分离
4.1.1样品采集
从活禽采集的样品应包拆气管和泄殖腔拭了，后者需带有可见我便，对维禽采集拭子容易造成损GB/T 16550-2008
价，可采用收集新鲜馨使代替。死禽以脑、肺脏，脾脏为主，也可来集其他病变组织。4.1.2样品处理
样品置于含抗生素的等诊磷酸盐缓冲液(PBS)(pH值7.G~7.4)，抗生素视条件而定，但组织和气管拭了保存液中应含青舞素（2000L/mL）、链霉素（2mg/mL）.卡那舞素（50ug/mL）和制荫霉素（100OJ/mL），而辈便和殖腔拭子保存腋抗生索浓度应提高五倍。加人抗生素后调pFHI值到7.0~7.4。类使和搅碎的组织，应用含抗生素的PS溶液制成10%（g/ml）~-20%（g/mL)的悬浮液，在温下静置1h～2h，将粪便或组织的悬浮液在4下以3000g离心5min,取清液进行鸡胚接种。4.1.3鸡胚接种
用1mL注射器吸瑕上清液按每枚气mL，经尿囊腔接种至少五枚9日龄～11日龄的SPF鸡还，接种后，35℃~37孵育1d-~718h后辑8h观察鸡胚死亡情湿4.1.4病毒收获
18h以后死的和濒死以更孵化时存活的鸡肝置4℃球箱4h41，无菌来集尿囊液。4.2病毒鉴定
4.2.1血凝试验
对可血凝试验呈脑性的静品采具性或血凝效价很低，妞用SPF鸡
分离阴性。力法间案
4. 2. 2血凝抑制试验
采用新城疫而消进行
4.3致病指数测脂
经确定存在病毒然殖的
症毒致殖
死鸡不平鸟
1）将解馄感染尿液
每个獅释经尿蔓腔
搜稀程液工
筷日照两
5）最小致死望
37℃增
连续观Www.bzxZ.net
固试验
提香有
能粮钙下列指影
9甘橙
行血凝趣制试。如果没有血凝活岩仍阴性认为新城疫病萨
丙毒繁殖，
莓力判定：
韩法简第G章。
或10---10%。，
鸡胚，每枚鸡压接种0.1ml置于
钟另外枚鸡，每枚鸡肝接种
能起所有用此稀释度接种的鸡胚死芒的最大稀释度，6）MDT是指囊引起所有鸡还死亡的平均时间(h)针算见式(1)。&
或中：
NXXXNXY+
X小时死亡的胚数
Y小时死亡的胚数；
胚死产时间，单位为小时(h)；
死亡的总胚数：
b）接种致病指数(ICFI)测定:
---(1 )
1)HA滴度高4iog2（人于1/16)以上新鲜感染尿囊液（不超过24h～48h，细菌检验为阴性）.用无等渗盐求作10倍稀释：2）脑内接种出壳21h40h之问的SPF继鸡，共接种10只，每只接种0.0mL3）每24 h观察一次，共观察8 d；4)
每天观察应给鸡打分，正常鸡记作0，病鸡记作1，死鸡记作2，（每具死鸡在其死斤的每日观察中仍记2）：
5）ICPI是每以鸡8d内所有每次观察数值的平均数，计算方法见式(2)。ICPI
式中：
Z,—8d 累计发病数；
-8d累计死数；
-8 d枭评观察鸡的总数。
接种教病指数（IVPI)测定：
2.×1+3.×2
CB/T165502008
HA滴度高于41og2<大于1/16）的新鲜塞液（不超过24h～48h，细菌检验为阴性），用无菌等渗盐水作10倍稀释；
静脉接种六周龄的SFF小鸡，接种10只，每只鸡接种0.1mL；每天观察1次，其10d，每次观察要记分，正常鸡记作0,病鸡记作1,瘫痰鸡或出现其他神经症状记作2，死广鸡记作3（每只死鸡在其死后的每凹观察中仍记作3），IVTI是指每只鸡101内所有每次观察数值的平均值，计算方法见式(3)。IVPI
式中,
-10d累计发病数；
4.4结果判定
-10d累计瘫痪数：
-10d累计死亡数
2.X1+2X2 12X3
10d蒙计观察鸡的总数
结果定细如下：
）：MDT低Go为弱市型NI>V,MDT在G0h～9Oh为中等毒力型NDV,MIYT天于为低毒力NDV
b）·ICIT越大，NDV致病性越强最强毒力病毒的ICPI接近2.0，而弱游株毒刀的ICPI为0；e）IVPI越大，NDV致病性越强，最强毒力病毒的IVPI达3.,而弱毒株的IVPI为0。血凝试验
5.1材料与试剂
5.1.1器材：普天平、分析天7、普通离心机、微型振离器、煮沸消毒器、冰箱高压灭菌器、微量移液器、滴头、96孔V形血凝反应板。5.1.2PH7.2磷酸盐缓冲液（PBS)配制方法参附录A。5.1:31%鸡红细胞总液配制方法参见附录B。5.1：4：标准新城疫病毒抗原、购入的标准新城疫病毒应检测其而凝效价进行无菌检验，以检查与所标IIA效价否相符。若不衍，应重复检测并到相关实验室验证。血凝试验操作程序
取凝试验操作程序如下：
a）取96孔V形微量反应板，用微量移液器在1孔～12孔每孔加0.025mLPBS，6）：吸取0.025m病毒悬液班人第1孔中，吹打3次～5次充分混句：从第1孔中吸取0.025ml.混勾后的病毒液加到第2孔，混勾后吸敢0.025mL加人到第3孔，依次进行系列倍比稀释到第11最后从第11孔吸敢0.025mL弃之，设第12孔为PI5GB/T165502008
对照；
rl)每孔再 0. 025 mI, PBS;
c）每孔加入0.025mL体积分数为1%的鸡红细悬液；振荡混勾反应混合液,室温 20 ℃～25 ℃下静骨 10 min后观察结果,者环境温度太高,放 4 ℃静置60min,PBS对照孔的红绷胞成明显的钮扣状沉到孔底时判定果，5.3结果判定
结果判定细如下；
&）在PS对照孔出现止确结果的情况下，将度应板倾斜，观察红细胞是香完全集。以完全凝集的病毒最大稀释度为该抗原的妞凝滴度：党垒凝集的病球的最高稀释倍数为1个血凝单位w
如果没有血凝活性或性效价褪低来用PP鸡胚用初代离的尿衰液继续传两代，若仍b)
为阴性，则认为新城疫端蒂分离阴性。）对于凝试验呈康
血凝抑制试验
6. 1 材料与试剂
6. 1. 1 间 5. 1e9
6.1.2试剂5. 2
品应采用新城疫标准阳性血清巡一款进行施凝抑制试验。调抑制抗修
6.1.3标准抗 N尊Y
6. 1. 41个血凝削病丧液制聋
方法举例为：如病效价为91
6.1.5HI效价1ag2时可维
6.2II试验程屑
HI试验操作群序姆下
a）根括血凝酸著果配制4嘴
单位I
数化表1
原的稀释倍1：6
4HAL抗原
遵圳稀释的孔数
(4HAU)
判4个单位的稀释倍数，
病毒稀释1暑倍即可
起100%通象的病毒最高希释倍
潮凝滴度1题56.则4IIAU抗
原加象到mLPBS中即为
b）取 95孔V形薇蜂迹板秋液器在第望乳第 11 孔歸人g025 PBS,第12孔加人0.05mLPBS.
布第1孔加人0.0城疫标准阳性血清，充分混勾感整出0l至第%孔，依次类推，倍比稀释至第 10双第10焱去 0. 025 mL,第lk为阳性厨照,第 12 孔为 PBS对照。在第1孔~第11 孔各加%0.025ml.肾AT抗原,轻叫底应板,使反应物混合均匀,室温下(约20-~25℃)静置不少gemain,t℃不少上60amin每孔加人0.025mL体积分数为1%的红细施悬液，轻嘉混匀后，室温（约20℃~25℃)静置约10 min,若坏境温度太高,放 1 ℃静置 60 min，当 PBS对照孔红细胞呈明显钮扣状沉到孔底时判结果。
6.3结果判定
果判定细则娜下，
a）在PBS对照孔出现正确结果的情况下，将反应板倾斜，从背侧观察，红细是否呈泪珠状流下。涵度是指产生完企不凝集（红细胞完全流下）的最高稀释度。只有当即性血清与标推抗原对照的 HI滴度不火21og2,阳性血消与标准抗原对照的 HT滴度与已知滴度相差在 1个稀释展范制内，并且所用阴，阳性血清都不发生自凝的说下，H试验结果节期定有效。，4
GB/T 16550—2008
尿囊液HA效价大于等于lag2，月标准新城疫阳性血清对其HI效价大于等于4log2，判为b)
新城疫病毒。
c）对确定存在新城度病毒繁殖的尿斑液应进一步测定其毒力，方法见4.3。7反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）.7.1仪器设备
所用仪器设备如下：
PCR仪：
高速台式冷冻离心机：最大商办000g饮生物安全柜；
冰箱：
水浴锅；
微量穆液器
组织勾浆器
电泳仪，
电泳槽：
紫外凝膜烟
所用试剂
电费费
读剂 Trzol
三氯电
7.3，操作程序
谢新开启的
样品的著处理
瑕200高
的上湾提
7.3.2病毒核酸的提取
RNA 提取应在择
使用：提取RNA时
维制备区
鑫按进RTPCR鉴定：
料和漆器应鑫过消毒处理：次剂RNA酸污染：问时立阳性对照和解性对鑫操作步如下（桦品以鸡胚尿囊液为)：用Triz0l提圾核酸
在无 RNA酶的避心管中加人200μL尿滚液扇加入1LTrinal,摄荡20s，室温静置o min;
加人200μl.三氯甲烧潮倒混匀，室舒置10 min，以12t00r/min离心15min；h).
管内液体分为三层，取500上清液于离心管中人500μL，预冷（.20℃）的异内醇，颠倒混勾，静置10min，以12000r/mi离心15min沉淀RVA，弃去所有液体（离心管在吸水纸上控干)；
人700叫L预冷（-20℃）的75%乙醇洗涤，颠间握句2次～3次以12001/mim离心lomin;
调水浴至60℃，室温卜-F燥10minf）加人40 μL DEPC水，60C金属浴中作用10 min，充分融解RNA，=70℃保行或立即使用。7.3.3配置RT-PCR反应体系
在样品处理区内山专人按表1给出的程序分步进行，注意只能在试剂准备区打并和配制试剂，配制完毕后应及时将剩余试剂放回贮存区域。将适量的核酸样品小心加入装有反应液体的反应管内，盖5
GB/T 16550—2008
紧盖子并做好标记，参照表1中反应体系配置RT-PCR扩增，表 1 RT-PCR 反应体系配置表
无RNA酶灭菌粗纯水
10×缓种陂
RNA 酶抑制剂
AMV反转录酶
Tan酶
上游引物7
下游引物
模板 RNA
休积/pL
注：上游引物的序列为5'-AIKHCYCCAGAYCTTCTAC-3'，下游引物P2的列为5-CTCCCACT-GCEALHIIGIGATAATCX: -3',Y 为并碱基,7.3. 4RT-PCR
按照表1中的加样顺序全部加完后，充分混勾·腾时离心，使液体都沉降到PCR管底。在每个PCR管中加人-游液体不蜡(约 20 μL)，同时设立阻性对照和阴性对照。循环条性为：
a）第一阶段，反转录42 t/45 tmin;b）第二阶段，预变性95%/3nin;c)第三阶段,94 /30 s,55 C/30 s,72 ℃/45 s,30 个循环;d）第四阶段,2 ℃ min.
最后的 RT-PCR 产物置 4 ℃保存,7.3.5电泳
操作程疗如下
制备 1.5%琼脂糖凝胶板：
5 μL PCR产物与 0. 5 μL 加样缓冲液混合,加人琼脂糖凝胶板的加样孔中;b)
加人INA分子质量标准物：
d）盖好电泳仪，描好电极，5V/cm电压电泳30tnin~~40tnin紫外线灯下观察结果，凝胶成像仪扫描图片存档，打印：e>
）用分子质量标准物比较判断PCR片段大小。7.4结果判定
结果判定细则如下：
a）出现0.5 kb大小左右的日的片段（与阳性对照大小相，参见附录 C),而阴性对照无自的片段山现方判为新城疫病垂阳性。b）对于扩增到的且的片段，需进步进行序列测定，从分了水平确定其致病性强弱。根据序列测定结果，对毒袜F基因编码的氨拆酸序列进行分析，如果毒株F2蛋白的C端有“多个性氨基酸线基”,F1蛋白的N端即I17位为苯丙氨酸,可确定为新娠疫毒感染。“多个碱性氨酸\指在113位到116位残基之间至少有二个精氢酸或赖氮酸。6
综合判定
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8.1临床诊断符合第3章规定的临床症状和病理变化，按第4章进行病毒分离与鉴定结果为新城疫病赤阳性且ICPI0.7，诊断为新城疫8.2临床诊断符合第3章规定的临床症状和病理变化，按第7章进行RT-PCR检测结果呈阳性月经序列分析证明F蛋白裂解位点具有强毒特征，诊断为新城疫。8.3患禽没有明显的临床症状和病理变化，但病原检测合8.1或8.2,可判定为新城疫病毒强毒感染。
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附录A
（资料性附录）
PH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)配制
PH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)配制：氯化钠（VaCI）
氯化钾（KCI)
磷酸氢三纳(NaHPO)
磷龄二氢纳(KH.PO)
加蒸馏水至
1 000 ml.
将上述成分依次溶解，用盐酸（HCI)遍pH至7.2，分装，121C、15min高压灭菌。8
附录B
（资料性附录）
1%鸡红细胞悬液（RBC)制备
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采集至少三只SPF公鸡或无离流感和新城疫抗体的非免疫鸡的抗凝血液，放人离心管中，加人三倍～四倍体积的PIS勾，以2000r/tnin离心5min～10min，去掉血浆和口细跑层，重复以上过程，反复洗涤三次（洗净血浆和白细胞），故后吸取压积红细胞用PBS配成外积分数为1%的悬感液，于4 ℃保存备用。
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（资料性附）
新城疫病毒 KT-PCR 检测阳性参照图新城疫病毒 RT-PCR 检测阳性参照图C—
C.2说明
C. 2. 1琼脂糖凝胶的泌度为 1.5%,·
C.2.2I>NA相对分质量标准物(Market)为DJ.2000。10
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