本部分规定了海洋石油勘探开发作业中使用或生成后并排入海洋的部分污染物在生物毒性检验中采用的试验方法，以及试验方法中有关样品的处理、实验生物、试验程序、结果判定、质量控制等要求。本部分适用于海洋石油勘探开发作业中使用或生成后并排入海洋的钻井液、基液、钻屑和生产水的生物毒性检验，本部分限定外的污染物的生物毒性检验可参照使用。 GB/T 18420.2-2009 海洋石油勘探开发污染物生物毒性 第2部分：检验方法 GB/T18420.2-2009 标准下载解压密码：www.bzxz.net

ICS 13.030.20
中华人民共和国国家标准　
GB/T18420.2—2009
代替GB/T18420.2--2001
海洋石油勘探开发污染物生物毒性第2部分：检验方法
Biological toxicity for pollutants from marine petroleum explorationand exploitation-Part2：Testmethod2009-03-11发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2009-11-01实施
GB/T18420.2—2009
规范性引用文件
术语和定义
采样、送样和样品保存
实验生物
设施和设备
试验程序
试验结果分析和判断
质量控制·
检验报告：
附录A（资料性附录）
附录B（规范性附录）
附录C（资料性附录）
附录D（资料性附录）
附录E（资料性附录）
附录F（资料性附录）
附录G（资料性附录）
参考文献
生物毒性试验结果原始记录表
生物毒性试验结果判定流程图··LCse和ECsa的计算方法·
Spearman-Karber计算法和TrimmedSpearman-Karbcr计算法正态性检验和方差齐性检验·
Dunnett's检验和Steel's多对--秩检验生物毒性检验报告表
《海洋石油勘探开发污染物生物毒性》分为两个部分：第1部分：分级；
第2部分：检验方法。
本部分为第2部分。
GB/T18420.2—2009
本部分代替GB/T18420.2一2001《海洋石油勘探开发污染物生物毒性检验方法》。本部分与GB/T18420.2-2001相比主要变化如下：将“96h换水式生物毒性试验”的术语和定义修改为“静水式生物毒性试验”的术语和定义（2001年版的3.2，本版的3.1)，增加了“半数有效浓度”的术语和定义（本版的3.4)；一-在“采样、送样和样品保存”一条中增加了关于“基液”的内容（本版的5.1.1和5.1.2.2)；—在“实验生物”章增加了4种实验生物及其相关内容（本版的6.1～6.4)；-一增加了“基液”和“合成基钻井液”的贮备液配制方法（本版的8.1.2.1.3和8.1.2.2)；增加了以生长作为观测指标的生物毒性试验方法的相关操作（本版的8.4.6.2.2)；-修订了“结果的有效性”的部分内容（2001年版的10.1，本版的9.1)；在附录中增加了部分数据处理和结果计算的方法示例，以及生长毒性试验的原始记录表（本版的附录A～附录F)。
本部分的附录B为规范性附录,附录A、附录C、附录D、附录E、附录F、附录G为资料性附录。本部分由国家海洋局提出。
本部分由全国海洋标准化技术委员会（SAC/TC283)归口。本部分起草单位：广东省实验动物监测所、国家海洋局南海分局。本部分起草人：黄韧、魏社林、吴进孝、郑琰晶、王颖、王国栋、周锦。本部分所代替标准的历次版本发布情况为：-GB/T18420.2--2001。
1范围
海洋石油勘探开发污染物生物毒性第2部分：检验方法
GB/T18420.2—2009
本部分规定了海洋石油勘探开发作业中使用或生成后并排人海洋的部分污染物在生物毒性检验中采用的试验方法，以及试验方法中有关样品的处理、实验生物、试验程序、结果判定、质量控制等要求。本部分适用于海洋石油勘探开发作业中使用或生成后并排人海洋的钻井液、基液、钻屑和生产水的生物毒性检验，本部分限定外的污染物的生物毒性检验可参照使用。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。GB17378.3海洋监测规范第3部分：样品采集、贮存与运输GB17378.4-2007海洋监测规范第4部分：海水分析3术语和定义
下列术语和定义适用于本部分。3.1
staticbiological toxicitytest静水式生物毒性试验
试验期间内不更换试验溶液，进行观察、测定生物异常或死亡效应的试验。3.2
无可见影响浓度noobservedeffectconcentration(NOEC)实验生物暴露在一组不同浓度的试验溶液一定时间后，通过观察实验生物的不良影响，并比较试验组与对照组统计分析结果，判定出对实验生物无显著影响的最大浓度。3.3
半数致死浓度half lethalconcentrationLCs5o
在一定观察期内，造成50%的受试生物死亡的毒物浓度。[GB17378.7---2007,定义3.10]
半数有效浓度halfeffectiveconcentrationECso
在一定观察期内，引起50%受试生物产生某一特定效应，或者是实验生物的某效应指标被抑制一半时的毒物浓度，以ECso表示。4原理
海洋生物的各种生理活动受海洋环境影响，通过观察测定实验生物在一定试验期间内接触试验物质后的异常或死亡效应，得到海洋石油勘探开发污染物对实验生物有明显影响的具体浓度。1
GB/T18420.2-2009
5采样、送样和样品保存
5.1样品的采集
5.1.1采样数量
采样量：钻井液5L，基液5L，生产水5L；采样量应足够供3次重复试验的用量5.1.2采样地点
5.1.2.1钻井液样品从排放口或泥浆池采集。5.1.2.2基液样品采自贮存基液。5.1.2.3生产水在排放点的排放口采样。5.2包装、运输和贮存
5.2.1包装
采送样品应用情性材料制成的容器密封包装.如聚乙烯塑料桶。5.2.2运输
按照GB17378.3的规定贮存和运输样品，受检样品应在48h内送达生物毒性实验室。5.2.3标签
所有样品容器上应标明样品名称、钻井代号、油井代号、生产或使用者、采样人、采样时间、采样方式、采样数量等。
样品送达实验室后送样人应填写送样表，样品接受人应检查样品标签和包装是否完整，并对样品进行编号、签字和记录存档。
5.2.4购存
生产水样品应贮存于4℃～8℃，其他样品应贮存在阴凉处。6实验生物
6.1实验生物的种类
6.1.1仔虾：中国明对虾（Fenneropenaeuschinensis）、斑节对虾（Penaeusmonodon）、长毛明对虾（Fenneropenaeuspenicillatus）、脊尾白虾（Palaemoncarincauda）、凡纳滨对虾（Litopenueusvannamei）五种虾的仔虾。
6.1.2卤虫(Artemia)
6.1.3蒙古裸腹涵（Moinamongolicu）6.1.4裸项栉虾虎鱼（Ctenogobiusgymnauchen）6.2实验生物来源及品质
6.2.1仔虾
仔虾宜实验室自繁饲养，也可自货源稳定、信誉好的苗种场购买。仔虾购入后应在实验室驯养48h后用于毒性试验，自繁饲养的仔虾应驯化24h后用于毒性试验。应选活力好，体色透明的仔虾用于试验。
6.2.2卤虫
可实验室自繁收集卤虫，也可购买商品卵孵化：按1.0g/L的比例取适量卤虫卵加人稀释水中，在25℃、盐度30～35、光照20001x～30001x的环境条件下充氧孵化。应取同批次孵出的无节幼体用于毒性试验。
6.2.3蒙古裸腹涵
宜实验室自繁收集。
6.2.4裸项栉虾虎鱼
宜实验室自繁收集。
6.3实验生物饲养条件
6.3.1仔虾
仔虾饲养的适宜条件见表1。
饲养条件
水温/℃
6.3.2卤虫
中国明对虾仔虾wwW.bzxz.Net
表1仔虾实验室饲养条件
斑节对虾仔虾
长毛明对虾仔虾
26～29
脊尾白虾仔虾
GB/T18420.2-2009
凡纳滨对虾仔虾
23～30
在水温22℃～27℃、盐度30～35、自然光照的条件下培养，每天投喂盐藻、扁藻或小球藻等单胞藻。
6.3.3蒙古裸腹
在水温22℃～27℃、盐度26～30、自然光照的条件下培养，每天投喂盐藻、扁藻或小球藻等单胞藻。
6.3.4裸项栉虾虎鱼
实验前1周采收受精卵并置于水温27℃～28℃、盐度25～32、pH7.6～8.2条件下充气孵化，收集初孵仔鱼并记录孵出日期，同一批收集的仔鱼孵出时间间隔不能超过24h。仔鱼的饲养条件为水温25℃～30℃、盐度20～30，自然光照，2日龄投喂轮虫，15日龄后可投喂卤虫幼体或轮虫。6.4实验生物开始试验的日龄和观测指标6.4.1仔虾：小于仔虾期10d(P1o期)的仔虾，以死亡做观测指标。6.4.2卤虫：卤虫卵孵化20h～24h的幼体，以死亡或生长做观测指标。6.4.3蒙古裸腹涵：I龄幼体，以死亡做观测指标。6.4.4裸项栉虾虎鱼：3日～10日龄的仔鱼，以死亡做观测指标。6.5实验生物的质量控制
6.5.1实验生物应健康正常，养阶段的死亡率应小于10%。6.5.2应进行标准毒物对实验生物的24h急性毒性试验，建立各批次实验生物的24hLCso范围，本试验所用标准毒物为分析纯的十二烷基硫酸钠（sodiumdodecyl sulfate,SDS)。7设施和设备
7.1设施
7.1.1饲养实验生物的水池或水族箱等。7.1.2可控照明装置。
7.1.3饲养实验生物的控温、充氧、循环清洁海水的设备，包括制冷和加热的控温设备、充气设备、循环水设备、水过滤设备等。
7.2试验容器及溶液体积
7.2.1仔虾试验溶液体积应为1000mL，试验容器可采用玻璃水槽等玻璃容器。7.2.2卤虫无节幼体试验溶液体积应为100mL，试验容器可采用烧杯等玻璃容器。7.2.3蒙古裸腹试验溶液体积应为100mL，试验容器可采用烧杯等玻璃容器。7.2.4裸项栉虾虎鱼仔鱼试验溶液体积应为200mL，试验容器可采用烧杯、水槽等玻璃容器。7.3环境因子测定的试剂和仪器
溶氧仪、盐度计、pH计、温度计。也可采用分光光度法测定溶解氧含量，测定的试剂和仪器应符合GB17378.4—2007第32章的规定。3
GB/T 18420.2—2009
7.4其他
高速揽拌器、显微镜、胶头滴管、量筒、手抄网、酶标板或者小离心管等。8试验程序
8.1检验样品的准备
8.1.1稀释水的准备
稀释水应清洁、无毒、水质稳定且对实验生物适宜，宜使用取自清洁无污染海区水质稳定的海水作为稀释水。若条件不许可，可使用人工配制海水，配制成与纳污水体相同的盐度后使用。8.1.2备液的配制
8.1.2.1钻井液贮备液的配制
8.1.2.1.1水基钻井液
按体积比取1份钻井液加人9份稀释水，2000r/min～3000r/min搅拌15min，然后加水稀释为试验组的最高浓度，继续搅拌5min，静置60min后取上层悬浮液作为贮备液。8.1.2.1.2油基钻井液
按体积比取1份钻井液加人9份稀释水，2000r/min～3000r/min揽拌15h至絮状，然后加水稀释为试验组的最高浓度，继续搅拌5min，静置60min后，避开表面油膜，取水相部分作为贮备液8.1.2.1.3合成基钻井液
按8.1.2.1.2的规定配制，
8.1.2.2基液贮备液的配制
按8.1.2.1.2的规定配制
8.1.2.3生产水贮备液的配制
取-定体积的生产水加人稀释水中，2000r/min搅拌15min，配制成预定浓度的贮备液，8.2组织固定液的配制
8.2.1固定液的使用
固定液用于以生长做观测指标的生物毒性试验中生物个体的组织固定。固定液可采用中性甲醛固定液(3%～5%)或鲁哥氏液。
8.2.2中性甲醛固定液(3%~5%)
以pH7.2～7.4的磷酸缓冲液为溶剂配制，配制后应密封并保存在阴凉处，保存时间不超过-个月。3%中性甲醛固定液配方：蒸馏水925mL，加入无水磷酸氢二钠6.5g.及磷酸二氢钠4.0g，充分溶解后加人甲醛（40%)溶液75mL。5%中性甲醛固定液配方：蒸馏水875mL，加入无水磷酸氰二钠6.5g，及磷酸二氨钠4.0g，充分溶解后加入甲醛（40%)溶液125mL。8.2.3鲁哥氏液
鲁哥氏液又称碘液，配制方法：取6g碘化钾溶于20mL蒸馏水中，搅拌到完全溶解后，加入4g碘，等碘充分溶解后，加入80mL蒸馏水，贮存在棕色试剂瓶内，8.3预备试验
宜选用2种或2种以上的实验生物进行试验。以死:率为观测指标的预试验应尽量确定出全部死亡和无死亡的浓度范围，以生长为观测指标的预试验应确定出能引起50%以上（低于100%）作用效果和50%以下（高于0%）作用效果的浓度范围。具体操作按照8.4。8.4正式试验
8.4.1试验浓度设置
用贮备液和稀释水配制试验溶液，参考预试验结果设定5个等比浓度组和1个空白对照组，等比系数不宜大于2.0，每个试验组应设4个重复，每个容器应放10个实验生物个体。如果样品毒性较低，则应保证试验死亡数据至少能满足计算LCs或ECso的最低要求。4
8.4.2实验生物移入
8.4.2.1仔虾
GB/T18420.2—2009
用手抄网在驯养池中随机选择实验生物并及时放入试验容器内。弃用跃出或损伤的生物。在试验操作过程中，应在30min内完成分放实验生物。8.4.2.2卤虫
用胶头滴管在驯养容器随机吸取卤虫幼体，然后小心移入试验容器。尽量减少分放实验生物的时间，尽量减少生物移入过程中对各浓度组试验溶液的稀释。8.4.2.3蒙古裸腹涵
按照8.4.2.2规定的方法操作。
8.4.2.4裸项栉虾虎鱼仔鱼
按照8.4.2.2规定的方法操作。
8.4.3充气要求
当试验溶液的溶解氧饱和度低于60%时，应对试验溶液进行轻微充气，充气气泡为60个/min～100个/min。如浓度组进行充气，同样对照组也应充气。8.4.4试验的环境因子
试验适宜的环境条件为：水温23℃～28℃，盐度20～35，pH7.6～8.6。试验过程中水温变化范围不应超过2℃，盐度变化范围不宜超过2,pH值变化范围不宜超过0.4。8.4.5饲喂
8.4.5.1仔虾宜饲喂卤虫无节幼体，每个仔虾每天饲喂10个卤虫无节幼体。8.4.5.2卤虫幼体和蒙古裸腹饲喂扁藻、小球藻等单细胞藻类，藻液离心后饲喂（离心转数3000r/min～4000r/min)，避免加人藻液引起试验溶液体积的明显改变。8.4.5.3裸项栉虾虎鱼仔鱼宜饲喂轮虫，每条仔鱼每天投喂500个轮虫，每个试验容器投喂体积不超过0.2mL。
8.4.6观察和记录
8.4.6.1仔虾
毒性试验持续时间为96h，每24h观察实验生物，移去死亡个体，将死亡个体数记录在原始记录表内，见表A.1。轻触无反应或在体视显微镜下观测心脏停止跳动均可判定为死亡。8.4.6.2卤虫
8.4.6.2.1以死亡为观测指标的毒性试验，持续时间为96h，每24h观察实验生物，移去死亡个体，将死亡个体数记录在原始记录表内，见表A.1。沉到容器底部的幼体在15s内仍不能游动者，即认为已死亡。
8.4.6.2.2以生长为观测指标的毒性试验，持续时间为72h。72h时用吸管吸出存活个体置于酶标板或离心管中，加人鲁哥氏液或中性甲醛固定液(3%～5%)固定后，吸出卤虫置载玻片上，在4倍物镜下用目镜测微尺观测体长，或使用显微镜摄像系统的软件进行体长测量，卤虫体长为尾凹到头部的最长距离。将体长观测值记录在原始记录表内，见表A.2。8.4.6.3蒙古裸腹
毒性试验持续时间为72h，每24h观察实验生物，移去死亡个体，将死亡个体数记录在原始记录表内，见表A.1。沉到容器底部的蒙古裸腹在15s内仍不能游动者，即认为已死亡。8.4.6.4裸项栉虾虎鱼仔鱼
毒性试验持续时间为96h，每24h观察实验生物，移去死亡个体，将死亡个体数记录在原始记录表内，见表A.1。体色不透明或身体弯曲，且用胶头滴管轻吹无反应的判为死亡个体。8.4.6.5环境因子的测定和记录
每次试验溶液配制后应测定并记录各项环境因子，如溶解氧、pH值、水温、盐度等，结束试验时宜5
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相应地测定并记录这些环境因子。测定值记录在原始记录表上，参见附录A。9试验结果分析和判断
9.1结果的有效性
试验溶液的溶解氧饱和度应达到60%以上。以卤虫作为实验生物的试验，对照组的死率不超过10%；以仔虾及仔鱼作为实验生物的试验，对照组的死亡率不超过20%。9.2试验结果的判定
9.2.1试验结果判定流程
试验结果判定流程见附录B。
9.2.2以死亡为观测指标的生物毒性试验9.2.2.1在大于或等于生物毒性容许值的试验浓度组未出现实验生物死亡.直接判定为大于生物毒性容许值。
9.2.2.2当小于生物毒性容许值的试验浓度组出现实验生物死亡，通过概率单位法、图表法等方法计算LCs值。概率单位法、Spearman-karber法和TrimmedSpearman-karber法计算LCso值和置信区间，作为受检物的生物毒性结果，计算方法参见附录C和附录D。9.2.2.3在小于生物毒性容许值的试验浓度组出现实验生物死亡，通过计算N()EC值辅助判定受检物的生物毒性。对试验结果进行正态分布和方差齐次检验，参见附录E，如符合正态检验和方差齐次检验则采用附录F的参数检验方法(Dunnett's检验）判定NOEC值。如不符合正态检验或方差齐次检验则采用附录F的非参数秩检验方法(Steel's多对一检验)判定NOEC值。9.2.3以生长为观测指标的生物毒性试验通过线性内插法计算ECso，以ECso值作为受检物的生物毒性结果，计算方法参见附录C；可以通过计算NOEC值来辅助判定受检物的生物毒性，按9.2.2.3规定的方法计算。10质量控制
10.1批间和批内质量控制
10.1.1每批次试验必须同时进行标准毒物的24h生物毒性试验，通过比较LCso值评价实验生物质量的稳定性。
10.1.2保证试验过程试验环境因子的稳定性，即试验期间的水温变化不应超过2℃，盐度变化不宜超过2，pH变化范围不应超过0.4，溶解氧饱和度应大于60%。10.2原始记录
原始记录应完整，包括采样的时间和地点、试验时间、样品的保存方法、采样和试验人员签名、试验所用的方法和技术、质量控制记录、试验的原始资料、仪器校准和维修记录、试验报告等。11检验报告
检验报告应包括检验报告表和试验报告。检验报告表包括：送样单位、送样人、送样时间、样品名称、样品编号、样品接受人、检验依据的标准、试验结果、出具检验结果的生物毒性试验室签章等。生物毒性检验报告表的格式参见附录G。不同试验的检验报告应分别撰写。
试验报告包括：受试样品表观描述；稀释水、贮备液和试验溶液的配制；试验所用仪器设备；实验生物介绍；对照组和各个浓度组死亡数；用浓度反应曲线或方程表示的试验浓度与实验生物反应的关系；检验人签名。
附录A
（资料性附录）
生物毒性试验结果原始记录表
表A.1为生物死亡毒性试验结果原始记录表。表A.2为生物生长毒性试验结果原始记录表。72h/96h静水式生物死亡毒性试验原始记录表表A.1
受试物质：
实验生物：
检验依据：
存活数
存活数
存活数
存活数
存活数
样品编号：
送样日期：
样品表观性状：
对照组
送样单位：
试验日期：
组1：
GB/T18420.2—2009
组2：
GB/T18420.2—2009
受试物质：
实验生物：
检验依据：
存活数
存活数
存活数
存活数
存活数
检测人：
组3：
样品编号：
送样月期：
样品表观性状：
表A.1（续）
送样单位：
试验日期：
组4：
复核人：
组5：
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