本标准规定了畜禽肉中氯霉素的测定方法。本标准适用于畜禽肉中氯霉素的测定。 GB/T 9695.32-2009 肉与肉制品 氯霉素含量的测定 GB/T9695.32-2009 标准下载解压密码：www.bzxz.net

1CS 67.040
中华人民共和国国家标准
GB/T9695.32—2009
肉与肉制品
氯霉素含量的测定
Meat and meat products-Determinalion of chloramphcnicol content2009-04-08发布
小华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2009-05-01实施
本标准制定过程中参号『*欧阻食品分析方法（Y3.6”本标推的附录A为资料性附录。
本标推全国肉禽蛋制品标准化技术委员会提出并归口，GB/T9695.32—2009
本标准起草单位：中国肉类食品综舍研究中心、中国商业联合会商业标准中心、武汉市疾病预防控制中心、江阴市产品质量监督所.应门市疾病预防控制中心。本标准主要起草人：宋永、赵榕、梁高道、郭文萍、吴东雷、骆和东、靳晓市、刘振宇。合品k伴网httn：//wuny：foodmatene1范围
肉与肉制品氯霉素含量的测定
本标谁舰定了裔禽肉中鼠霉素的测定方法，本标准适用于畜禽肉中氮靠素的测定。GB/T 9695. 32—2009
本标准检Hi限：气相色谱质谱法，检出限为0.2g/kg;嗨联免疫法为0.05/kg2规范性引用文件
下列文件中的条款通过（I3/T9G9！，本部分的引用而成为本部分的条款。凡是准H期的引用文件，其随后所有的修政单（不包括勘误的内容)或修订版均不适用上在部分·然而，鼓慰根据部分达成协议的各方研究尼否可使用这些文件的股新版本。凡是不注H期的引用文件，其最新版本适用于本部分，(H13/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T66822008.1S）3696：1987，M0D)GI3/T9695.19肉与肉制品取样方法3气相色谱-质谱法(确证法）
3.1原理
样品中氯霉素用之酸Z.酷提收，脂肪用正已烧去除，经C1净化，BSTFA一TMCS（99一1)衔生后，NCI源选择m/为466的特征离子为目标离子，在SIM模式下进行GC-MS测定。3.2试剂和材料
荠无特别说明，所用试剂均为分析纯，所用水应符合G13/T6682的要求。3.2. 1 氯等素:标准品,纯度99%。3.2.2甲醇：色谱纯，
3. 2. 3氯甲烷。
正已烷：色谱纯。
乙酸乙酯。
无水硫酸钠，
氯化钠。
N、O双兰甲能烷三氟乙酰胺(BS11A),三甲基氯硅烷(TMCS)
丙酮：色谱纯。
甲醇榕液，甲醇·水2「8.
3.2.13氯化钠溶液（40 g/1.)：称段4.00g氟化钠（3.2.7.7)，用水溶解，定穿至100mL，3.2.14甲醇氯化钠溶液：景取甲婷溶液（3.2.12)20ml.、氯化钠落液（3.2.13)80mL，混勺。3.2.15混合衍生剂：N,O-双=中基硅烷兰氟乙胺1兰甲基氯硅烷一99一1。3.2.16氯箱系标准储备溶液（c=0.：mg/ml.)：称取氟霉素标准品2.01g（精确允0.00c1g）.用内酮溶解并定容至m：诺备液存在℃冰箱中，可使用两个月3.2.1/氛霉素标雅1.作辫液：根据试验需要，期内调（2.2.10）稀解标准储备溶液（2.217），配成适当液度的标准工作溶液，
GB/T 9695,32—2009
3.3仪器设备
实验室常规设备及下列仪器，
3.3.1气相色谱质谱联用仪（GCMS)3.3.2分析半：可准确称重至0.0001g3.3.3分析天平，可确称重至0.01g。3.3.4离心机：5500r/min。
3.3.5涡旋仪。
3.3.6固相萃取装置。
3.3.7旋转蒸发仪，
3.3.8均质器
3.3. 9 振药器。
机械设备：用于试样的均质：包括：绞肉机，斩拌机等肉类组织粉碎机。3.3.11氮吹仪。
其案离心管：50ml.、[oml..
3C：固剂萃取社或相当者：200 ，3 tnl.3.3.13
3.4分析步骤
3.4.1试样液制备
3.4.1.1试样的制备
按GB/T9695.19规定的方法取样。至少取有代表性的试样200多，使用适当的机械设备（3.3.10）将试样均质，均质后的试样尽快分析，否则，应密封低温烂存，防Ⅲ试样变质或成分发生变化。贮存的试样在启用时，成贡新混勾。
3. 4. 1. 2 提取
称收10样品（精硫至001g)肾下50mL是寒离心管中.加人少量无水硫酸钢和30I让二酸鳍均质1min，以5000 r/min离心5min后,用吸管吸上层7酸乙酯子浓缩瓶中,残渣萨加人乙酸7.酯15mL重复提取样品，合并提取液。提取液在50℃水浴中旋转蒸发，除去乙酸乙.加人1mL中-氯化钠溶液(3.2.14)和4 m1.正已烷，充分振摇后,转移至10 mL具塞离心管中,用1 nL中醇-氯化钠溶液(3.2,11)清洗浓缩瓶，合并清洗滋于10 mI.具塞离心管中。旋0. min,经3 00心 /min 离心3 ti后,用吸管吸去正己婉,胍人4 ml。正己烷重复1述操作。然后在离心管中加人A ml艺酸乙醋，涡旋：min,经oo r/tr:t离心3inin后,用吸管吸出乙酸乙醋,加入1ml.乙酸乙酯重复」:述作,台并7.酸Z酯下上浓缩瓶中,在50“℃水浴牛璇转浓缩在还于,用5I让水溶解残渣，3.4.1.3净化
依次用5mL 中醇、 mL三氯巾烷,5 mL中醇、5 mL水活化C固相萃敢柱（3.3. 14)，然后加人述少骤得到的提取液,郝 5 mI.甲醇十水(3.2.12)淋洗色谱托，而25 InL甲醇洗脱于浓缩瓶中，洗脱液在下浓绍至近下，用10μ1.甲醇溶解残渣·并转移至10 ㎡l只塞离心管中，再用甲醇冲洗浓缩瓶，合详洗液，℃下用氮气吹。3.4.1.4衍生化
于吹1的试样残渣中加入100μL甲米和100μl.泥合衍生剂(3.2.15)盖紧密后，涡旋混勾1min，60℃下反应30min，然后在5℃℃下用氮气吹「，加人1ml.正已烷溶解残渣。3.4.2标准工作液制备
配制好的标准工作液按3.4.1.4步进行操作。3.4.3空自液制备
除不称取试样外，均按3.4.1步骤进行操作。2
3. 4.4测定
3.4.4. 1气相色谱-质谱法测定条件色谱柱：3-5MS30 m×0.25 mm×0.2 m)石英毛细管杜或和当者：载气：氮气，纯度学99.990%；
流遗:1. 65 mL/min;
进样口温度：250℃；
进样量:1 μL;
进样左试：无分流（保持【min进样：GB/T 9695.322009
往温程序:初始55 %.保持 1 min,以 25 %/min速度升至280 ℃,保持 6 min；NC1源：70cV
离源温度：150℃；
接口福度：280℃：
溶剂延迟:7 min;
反成气：中烷，纯度冷99.91为；选择离-f检测：
保留时间/min
CAP-TMS
3.4.4.2定性测定
检测离了n
466,468,376,378
进行样品测定时，如果检出的色谱峰保蹈时前与标雅样品相--致，并且在扣除背景后的样品质谱图中，所选择的离子均出现，而且所选择的离了比与标准样品衍小物的离了比相一致（各相关离了比在相关标准品的10%之内），则可判断样品中存在氯得素。3.4.4.3定量测定
吸取：叫衍半的试样液,标准液或空凹液注人气相色谱质谱联用仪中,以m/z166 为定量离下，标准工作液中氯霉案的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。根据试样液的峰面积，从标准非线上查出落液中对应的氯素浓度值，用标准丁作曲线对试样进行定量，样品溶液中氯需素衍生物的响应值均应在仪器测定的线性范内。在上述色谱条件下，氯筹素衔牛物的参考保留时间为12.58ni。氯霉素标准物质衍生物总离子流图和质谱图以及氟霉素标准物质衔牛物迷样离子质辨图参见附录A中的图A.1.图A.2、图A.3。3.4.5平行试验
按以上步骤，对回-试样进行予行试验测定。3. 5 结果计算
按式(1)计算样品巾氯舞素的含最：x
武中：
(G-G)XVX10 3
…试样中氰霉素的含量,单位为微克每『克(/k)；X
---从标难工作曲线」查得试样液中氛霉索的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL)；从标准工作曲线F查得空白液中氯稳素的度，单位为纳克征开（ng/ml)：试样定容体积，单位为最所（ml）；m一称取试的质量，单位为克（g）。结果算术平均值保留三位有效数疗，3.6精密度
在重复性条件下获得的需次独立测定结果的绝对差值不得超过算术均俏的10。全品伙伴网
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4酶联免疫法(EL.ISA 筛选法）
4.1原理
采用间接竞争FIISA方法，在酶标板微孔条「:包被偶联抗原，样本巾残留的氯霉素和微孔条上包被的码联抗原竞争抗氯需素抗体、加人酶标二抗后，加人底物显色，样本吸光值与其残留物氯霉素的含凰成负和关，与标妞线比较串乘以对应的稀释倍数，即可得出样品中氯藿素的含量4.2试剂
若无特别说明，所用试剂均为分析纯，所用水应符合（I3/T6682的要求。4.2.1乙酸乙酯。
4.2.2FL烷.
4.2.3氛霉素酶收免疫试剂盒，2%~8℃冰箱中保存，注：试剂盒应选月国家有关行政管理部门备案的生产商的合格产品。4.2.3.1酶标板：8孔×12条，包被有偶联抗原。4.2.3.2氯窄素系列标准液：0μg/L、0.05g/1..0.15#g/L.0.45μg/1.、1.35μg/1.、4.05μg/1.4.2.3.3酶标二抗。
4.2.3.4抗体工作液，
4.2.3.5底物液（A液），
4. 2. 3. 6
底物液（B液）
终止液。
洗涤液（浓缩液）。
4. 2. 3. 9
复溶液(浓缩液)，
复济作液:将浓缩复溶液 20 mL用水稀释至40ImL。4.2.3.10
4.2.3. 11洗涤1.作液：将淼缩洗涤液4Uml.用水稀释至800 mI..4.3仪器设备
实验室常规设备及下列仪器：
4.3.1游标仪：配备450nn、63m滤光片。4.3.2微量移液器：单道20μL.~-200μ、10C~-1000μl.多道250μL4.3.3恒温箱，
4.3.4离心管：50mL
4. 4分析步骤
4.4.1样本制备
样本用均质器均质后,称吸 3. 0 g于0.0;g至) ml. 离心管中,期人 6 ml. 乙酸乙酯(4,2.1),用振荡器振荡10 :t,于室温（20 ~-25 ）,5 500 r/1mim离心 10 mi,移取4 ml[层有机柑爷10 ml.1净的破璃试管中，50℃~～-50℃水浴氮气流下吹十,加人1m正己烷(4.2. 2),用涡旋仪涡动30，再加 1 InL复溶.作液（4.2. 3.10）,用涡旋仪涡动 1 min，室温（20 ℃ ~~25 ℃）、5 5C0 1/ni 离心15 min;除去上层有机相,取下层100 μl.周于分析，稀释倍数为 0.5 倍。4.4.2空白对照样本
取牵试样，按4.4.1步骤进行操作4. 4.3测定步骤
4.4.3.1微孔被及试剂的谁备：从冷藏环境中取出需发数量的微孔板和其他所带试剂，置于温(20 C~25℃)平衡 30 min 以上,并将不用的微孔板放人『封袋中,保存于2℃～8 ℃,4.4.3.2编号;将样本、标准、空白对照样本对应微孔按序编号:记录样本孔,标准孔和空样本孔所在的位置。江意所右试剂及样本溶液使用前均应播句。GB/T9695.32—2009
4.4.3.3加样，加100μL标推品、群在、空白样到划做的微孔中，再加人抗体工作液（3.2.3.4）5uu./孔，轻轻振荡混勾，Hi盖板膜盖板后置25避光环境中反应30min。4.4.3.4洗版小心搬开蓝板膜，将孔内液体用，封洗涤1.作滋（.2.3.11250μ1/孔，充分洗涤4次~5.衔次闻凝10s，用吸水纸拍4.4.3.5加酶标二抗:加[人酶标二抗(3.2.3.3)100 mL孔、轻轻振荡混匀,用盖板膜盖板后置25℃避光环境中30min.取出重复洗板北骤（3.5.4），4.4.3.6显件：加人底物液A液（3.2.3.5)59L/孔：世兆底物落B液（3.2.3.6)50L/孔轻轻振离渠匀、用盖极膜盖板后胃25避光环境反施15min：4.4.3.7测定：加入终止波（3.2.3.7)50μ1./孔，轻轻报荡混匀，设定姆标仪450nm及630mm双波长检测，测定每孔的吸光度低。
4.5结果计算
安式(2)计算白分吸光度值
相对吸光度值
式中：
标准溶液或样本溶液的平均吸光度值；B。-ppb标推溶液的平均吸光度值。B
X 105%
将式(2)计算得到的对吸治度值(%)对应氯源素(1多/I)的白然对数，作半对数整标校正曲线，根据样本的相刘吸光度值，从校正也线上查山溶液时对应的氯得素浓度值。按式（3）计算样品中氯霉素的含量：式中：
X-( A)×
m×10c0
试样中氯霉素的含量，单位为微克梅千克(u/k);试样的相对吸光度值（%)对应的氯带素含量，单位为微克排升（g/L)；空白栏本的相对吸光度值(关)对应的氯需素含量，单位为微克每Ⅱ(1g/1)：」“试样稀释倍数；
称取试样的质量，单位为克（）结果保留位有效数字，卧性结果应终过气柜色谱质谱达确证，4.6精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对值不得超过算术平均值的20为。3
GB/T9695.32—2009
附录A
（资料性录）
标准物质衍生物总离子流图、质谱图和选择离子质谱图A.1氯霉素标准物质衍生物的总离了流,见图 A.1(x 1vo t)
4.2氯特索标准物质行生物的质谱图，见图A.2100.0-
http：
430 449bZxz.net
A.3氯带素标准物质衔生物的选择离了质谱图，见图A.3.怀
http:
GB/T 9695.32--2009
CB/T 9695.32-2009
打：「划：2009年
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州家标
肉与肉制品氧蟹素含量的测定
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开本88℃×123:）171h印张0.75字数11千字2009年4月第－版2009年1月第一次印到书号：：55066·1369元5定价16.00元告由本社发行中心调换
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