本标准规定了化学试剂核苷酸含量、熔点、比旋光度、层析试验和干燥失重测定的通用方法。本标准适用于化学试剂核苷酸及其衍生物的分析。本标准不适用于药用核苷酸及其衍生物的分析。 GB/T 15356-1994 化学试剂 核苷酸测定通则 GB/T15356-1994 标准下载解压密码：www.bzxz.net

中华人民共和国国家标准
核苷酸测定通则
Chemical reagent
General rules for the determination of nucleotides1主题内容与适用范围
GB/T 15356—94
本标准规定了化学试剂核苷酸含量、熔点、比旋光度、层析试验和干燥失重测定的通用方法。本标准适用于化学试剂核苷酸及其衍生物的分析。本标准不适用于药用核苷酸及其衍生物的分析。2引用标准
GB/T 601
化学试剂
GB/T602
GB/T 603
GB/T 613
GB/T 617
GB/T 619
GB/T 6682
化学试剂
化学试剂
化学试剂
化学试剂
化学试剂
滴定分析（容量分析）用标准溶液的制备杂质测定用标准溶液的制备
试验方法中所用制剂及制品的制备比旋光度测定通用方法
熔点范围测定通用方法
采样及验收规则
分析实验室用水规格和试验方法GB/T 9008
GB/T 9721
3般规定
液相色谱法术语柱液相色谱法和平面色谱法化学试剂分子吸收分光光度法通则（紫外和可见部分）3.1本标准中所用的水、在没有注明其他要求时，应符合GB/T6682中三级水的规格。3.2本标准中所用试剂的纯度应为分析纯。3.3本标准中凡层析测定时，核苷酸R：值均应以在完全相同条件下的对照样品的R值为判断标准，且每次测定都不得省去作为判断标准的对照样品。3.4本标准中凡层析测定需作杂质限量检测时，应使用符合6.1.2.1条之规定的对照样品。4熔点测定
按GB/T617规定测定。
核苷酸的熔点数值可参考附录A(参考件）。5比施光度的测定
按GB/T613之规定测定。
核苷酸的比旋光度数值可参考附录A（参考件）。国家技术监警周1994-12-22批准276
1995-10-01实施
6层析试验
GB/T 15356---94
层析试验用于检测核苷酸的纯度及定性鉴别。所有核苷酸均应以下列方法中选择一种方法进行测定。
6.1纸层析
6.1.1方法原理
纸层析法是以滤纸为惰性支持物的一种层析法。分离原理属分配层析的范畴，它利用不同溶质在静止的水相，亦即纸上所吸附的水为固定相和沿纸流动的有机相(即流动相两相溶剂的不断分配而达分离的目的。核苷酸经层析后，常用比移值(R,)来表示各组分在层析谱中的位置。(Rr)值按式(1)计算：Rf= am
式中：R——比移值；
d。溶质迁移距离，cm；
d—一流动相迁移距离，cm。
·（1)
在一定的条件下,同一核苷酸的 Rr值是一定的。但由于影响 R;值的因素较多,一般都采用与对照样品对比，即根据样品与对照样品在层析谱中R值来进行鉴别，并可在254nm的紫外灯下观察，以显示出杂质斑点的多少和色量来确定样品的纯度。也可剪下斑点，溶于特定溶剂，用紫外分光光度计测定吸光度，并计算样品的含量和杂质的含量。6.1.2试剂及材料
6.1.2.1对照样品
纸层析和薄层层析所用的对照样品，主体含量不少于98.0%。6.1.2.2层析用纸
层析用纸是指具有一定强度、质地均勾平整的纯棉浆制成的滤纸。纸的裁切方向应使流动相能顺着纹理方向移动。定性用的层析滤纸灰分须小于0.1%，一般可选用新华一号层析滤纸。6.1.2.3展开剂
展开剂可参照附录B(参考件)之规定，使用前制备。必要时可选用其他展开剂。
6.1.2.4展开室
可选用大小适宜的标本缸。
6.1.3操作步骤
取新华一号层析滤纸，长30cm，离底边2cm处用铅笔划一条直线，在直线两端2cm处开始点样，点与点之间距离为2cm，点样扩散的直径不超过0.5cm。同一-张层析纸上可点数个样品，纸的宽度取决于样品的数目，并留有点对照样品的位置。称取0.005g核苷酸样品，精确至0.0001g，溶于0.5mL水或盐酸溶液[c(HCI)=0.01mol/L],必要时稍微加热溶解。用微量进样器或微量吸管点样，每次点样后须用冷风吹于，点样量按检测要求不少于5μL，即相当于50μg样品。核昔酸纸层析一般采用上行。将已吹干后的层析纸两边卷成圜簡状，用二根塑料丝上下固定。在一高为 36 cm 的标本缸内平放一培养血,内盛高度为 0.5 cm 的展开剂,将层析纸置于缸内以展开剂的饱和蒸气平衡2～4h后，将样品端朝下放入培养血中，盖紧玻璃盖。展开12～16h，流动相前沿即可上升26～28cm，此时将层析纸取出晾干或在50℃干燥。6.1.4观察吸收斑点
GB/T 15356--94
将除去展开剂后的层析纸，在254nm的紫外灯下观察，即观察出紫外吸收斑点。6.1.5结果的确定
6.1.5.1以50μg点样量，按规定展开并在紫外灯下观察，只观察出一个紫外吸收斑点，且与对照样品的R值一致，即可确定其层析试验为合格。6.1.5.2以50μg点样量，按规定展开并在紫外灯下观察，除显示出一个斑点外，其他核苷酸的斑点小于或等于按产品规格制备的杂质标准的斑点时，即可确定含其他核苷酸小于或等于标准。6.2薄层层析
6.2.1方法原理
薄层层析是一种将吸附剂均勾地铺在一块玻璃板上形成一薄层，在此薄层上进行色层分离的一种层析法，按分离机理可以分为吸附、分配、离子交换、凝胶过滤等法。本标准主要使用吸附薄层层析法。6.2.2试剂及材料
6.2.2.1对照样品
应符合6.1..2.1条之规定。
6.2.2.2硅胶GF
本品系白色均匀细粉及萤光粉，粒度平均在10～40μm之间，含有约13%的半水合硫酸钙。本品应附合下列分离要求：各取0.040g二甲基黄、苏丹、靛酚蓝，溶于100mL苯中。取2μL，点样于按6.2.3.1条之规定制备的硅胶GF板上，用苯展开10cm，色谱图应显示三个清晰的分离斑点，靛酚蓝斑点接近于起始点，二甲基黄在色谱图的中央，苏丹！介于二者之间。6.2.2.3展开剂
通常选用正丁醇十丙酮十冰乙酸+5%氨水十水=7十5十3+3十2（体积比）。必要时可选用其他展开剂。可参照附录B(参考件)或其他文献。6.2.3操作步骤
6.2.3.1制板
制备薄层板所用的玻璃板必需表面光滑，清洁，其大小可根据需要选择。小的可用载玻片，大的可裁成20cm×20cm的玻璃片。
取-定量的吸附剂（硅胶GF可按25~～30g加60～65mL水)在研钵中加水调成糊状，按玻璃板的尺寸取一定量的吸附剂糊均匀地铺成一厚度为0.2～0.3mm的薄层。若使用涂铺器可按制造厂商推荐的方法涂铺。铺成的薄层须置于水平台上室温干燥过夜。硅胶GF制板的时间从调成糊状到铺板不应超过 1.5 min。
市售的预制板经6.2.2.2条试验，符合分离要求的，亦可使用。6.2.3.2点样和展层
取薄层板一块，距底边1.5cm处为基线点样，点与点之间的距离为1.5cm，点样扩散的直径不超过0.2cm，点与点之间距离可视斑点扩散情况以不影响检出为宜。称取0.004g核苷酸样品，精确至0.0001g，溶于0.2mL水或盐酸溶液c(HCI)=0.01mol/LJ，必要时稍微加热溶解，用微量进样器或微量吸管点样，如要多次点样时，可用冷风将前一次点样吹干后，再点下一次样，点样量按检测要求不少于2μL，即相当于20ug样品，点样时必须注意勿损伤薄层表面。薄层层析可选用大小适宜的标本缸，将已点样的薄层板平衡后，将样品端朝下放入培养血中，薄层板漫人展开剂的深度不超过0.5cm，上行至流动相前沿离顶端0.5~～1.0cm处（展开距离一般在15~20cm）取出晾干，在50℃干燥除去溶剂。6.2.4观察吸收斑点
应符合6.1.4条之规定。
6.2.5结果的确定
应符合6.1.5.1及6.1.5.2条之规定。278
7含量的测定
按GB/T9721之规定，其中：
7.1测定条件
波长：用样品所需的最大吸收波长，吸收池厚度：1cm；
GB/T 15356-94
参比溶液：水或盐酸溶液[c(HCl)=0.1 mol/L)或盐酸溶液[c(HCl)=0.01 mol/L)。7.2测定方法
称取10 mg样品，精确至0.000.01 g,用盐酸标准溶液[c(HCI)=0.1 mo1/L)或盐酸标准溶液[c(HCl)=0.01mol/LI溶解，转移至1000mL容量瓶中,稀释至刻度,播匀。按测定条件7.1条之规定，测定吸光度。
7.3结果的计算
核苷酸的含量按式(2)计算：
A/e.M·1000
2×100
式中：-bzxZ.net
核苷酸的质量百分含量，%；
A—核昔酸样品在最大吸收波长处的吸光度，s-核苷酸样品的摩尔吸收系数，L/cm·mol，-核苷酸样品的相对分子质量；
吸收池厚度，cm；
溶波浓度，mg/L；
-换算系数。
8干燥失重
（2）
称取0.1g样品，精确至0.0001g。置于已在105士2℃干燥至恒重的称量瓶中，于105±2℃的电烘箱中干燥至恒重。
干燥失重按式(3)计算：
m - m2 × 100
式中：α——干燥失重,%，
恒重前样品的质量，名，
m恒重后样品的质量,g。
（3）
中文名称
腺嘌呤核苷-5°-磷酸(5'-
腺苷酸）
鸟嘌岭核苷-5°-磷酸(5'~
鸟苷酸）
胞嘧啶核苷-5'-磷酸(5'-
胞苷酸）
尿嘧啶核苷-5'-磷酸(5'
尿苷酸)
腺嘌呤核替-5'-二磷酸
(5°-腺苷二磷酸）
腺嘌呤核苷-5'-三磷酸
（5'-腺苷三磷酸）
腺嘌呤脱氧核苷-5'-磷酸
（5'-腺嘌呤脱氧核苷酸）
鸟嘌呤脱氧核苷-5°-磷酸
（5'-鸟嘌呤脱氧核苷酸）
胞嘧啶脱氧核苷-5°-磷酸
(5°-胞嘧啶脱氧核苷酸）
胸腺嘧啶脱氧核苷--磷
GB/T 15356--94
附录A
部分核苷酸的比旋光度、熔点和摩尔吸收系数（参考件）
英文名称
(缩写）
adenosine-5'-
monophosphate
(5'-AMP)
guanosine-5'-
monophosphate
(5'-GMP)
cytidine-5'-
monophosphate
(5′-CMP)
uridine-5'-
monophosphate
(5'-UMP)
adenosine-5'-
diphosphate (5'-
adenosine-5'-
triphosphate （5'-
adenine deoxyri-
bose-5'-phos-
phate(5'-dAMP)
guanine deoxyri-
bose-5'-phos-
phate(5'-dGMP)
cytosine deoxyri-
bose-5'-phos-
phate(5'-dCMP)
thymidine-5'
酸(5°-胸腺嘧啶脱氧核苷
phosphate :( 5'-
鸟嘌呤核苷-5'-二磷酸
（5'-鸟苷二磷酸）
guanosine-5
diphosphate ( 5'-
分子质量
熔点，℃(）
196~~200
190～200 d
183~184
比旋光度
—46°~—48°
C=5,1N NaOH
C=0. 5,H,0
C-0. 2,H,0
C 0. 4,H,0
C-1.2,H,O
C=4,H,0
摩尔吸收系数,L/cm·mol
hnaxtim
PmazX10%
中文名称
鸟嘌呤核苷-5'-三磷酸
（5'-鸟苷三磷酸）
胞嘧啶核苷-5'-二磷酸
（5'-胞苷二磷酸）
胞嘧啶核苷-5'-三磷酸
（5°-胞苷兰磷酸）
尿噻啶核苷-5'-二磷酸
5'-尿苷二磷酸）
尿嘧啶核苷-5'-三磷酸
(5°-尿苷三磷酸）
腺嘌呤核苷-3',5'-环式
英文名称
（缩写）
guanosine-5'-
triphosphate ( 5'-
cytidine-5'.
diphosphate ( 5'-
cytidine-5'-
triphosphate ( 5'-
uridine-5'-
diphosphate ( 5'-
uridine-5'-
triphosphate (5'-
adenosine-3', 5'-
cyclic
monophosphate
注：（1）d代表达到熔点后分解。GB/T 15356—94
续表A1
分子质量
熔点，c()
附录B
比旋光度
常用核苷酸展开剂的组成和配比表（参考件）
异丁酸+0.5mol/L氨水
异丙醇十浓氨水十水
95%乙醇+1mol/L乙酸钠
用氨水将水调节 pH 至 pH10
正丁醇+冰乙酸十水
正丁醇+丙酮+冰乙酸+5%氨水+水配
(体积比）
7+5+3+3+2
摩尔吸收系数，L/cm·mol
Amar+nm
βmarX103
纸层析常用展开剂
纸层析常用展开剂
纸层析常用展开剂
纸层析常用展开剂
薄层层析常用展开剂
薄层层析常用展开剂
附加说明：
GB/T15356—94
本标准由中华人民共和国化学工业部提出。本标准由北京化学试剂总厂归口。本标准由上海丽珠东风生物技术有限公司负责起草。本标准主要起草人何光珍、金承德。282
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