本标准规定了饲料中含硫氨基酸的测定方法。本标准适用于单一饲料、配合(混合)饲料及浓缩饲料。 GB/T 15399-1994 饲料中含硫氨基酸测定方法--离子交换色谱法 GB/T15399-1994 标准下载解压密码：www.bzxz.net

中华人民共和国国家标准
饲料中含硫氨基酸测定方法
离子交换色谱法
Determination of sulfur amino acids in feedstuffs-Ion exchange chromatography1主题内容与适用范围
本标准规定了饲料中含硫氨基酸的测定方法。本标准适用于单一饲料、配合(混合)饲料及浓缩饲料。2引用标准
GB/T6432饲料粗蛋白质测定方法GB/T6439饲料水溶氯化物测定方法3原理
GB/T 15399—94
饲料中的含硫氨基酸(胱氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸)用过甲酸氧化并经盐酸水解生成磺基丙氨酸和蛋氨酸砜，此二产物可用离子交换色谱法分离测定。4试剂
除特别注明者外，所有试剂均为分析纯，水为去离子水，电导率小于1MS。4.1过甲酸溶液
4.1.1常规过甲酸溶液：将30%过氧化氢（GB6684)与88%甲酸（HG3--1296)按1：9(V/V)混合，于室温下放置1h，置冰水浴中冷却30min，临用前配制。4.1.2浓缩料用过甲酸溶液：将常规过甲酸溶液中按3mg/mL加入硝酸银（GB670)即可。此溶液适用于氯化钠含量小于3%的浓缩料。当浓缩料中氯化钠含量大于3%时，氧化剂中硝酸银浓度可用下式计算：Ck ≥ 1. 454 X m × Cn
式中：Ck—一过甲酸中硝酸银的浓度，mg/mL；Cn一样品中氯化钠含量，mg/mL;m样品质量，mg。
4.2氧化终止剂
4.2.148%氢溴酸(GB621)
4.2.2偏重亚硫酸钠溶液：33.6g偏重亚硫酸钠(HG3--909)加水定容至100mL。4.3酸解剂
国家技术监督局1994-12-30批准1）
1995-07-01实施
GB/T 15399--94
4.3.16.0mo1/L盐酸溶液：将优级纯盐酸(GB622)与水按1：1(V/V)混合。4.3.26.8mol/L盐酸溶液：将优级纯盐酸（GB622)1133mL加水稀释重2000ml。4.47.5mol/L氢氧化钠溶液：取优级纯氢氧化钠（GB629)30g，加水溶解并定容至100ml。4.5稀释上机用柠檬酸钠缓冲液，pH2.2,0.2mol/LNa：称取柠檬酸三钠（HG3—1298)19.6g，用水溶解后加入优级纯盐酸16.5mL，硫二甘醇5.0mL，苯酚（HG3—1165）1g，最后加水定容至1000ml，用G4垂熔玻璃砂芯漏斗过滤。4.6不同pH及离子强度的洗脱用柠檬酸钠缓冲液：按仪器说明书配制。4.7三酮溶液：取萌三酮适量、按仪器说明书配制。4.8磺基丙氨酸-蛋氨酸砜标准贮备液，2.50μmol/mL：准确称取磺基丙氨酸105.7mg和蛋氨酸砜113.3mg，加水溶解并定容至250mL。4.9氮基酸混合标准贮备液：含有L-天门冬氨酸、L-苏氨酸等17种常规蛋白质水解分析用L-氮基酸各组份浓度为2.50μmol/mL。
4.10混合氨基酸标准工作液：吸取磺基丙氨酸-蛋氨酸砜标准贮备液（4.7)和氨基酸混合标准贮备液（4.8）各1.00mL，置于50mL容量瓶中，加稀释上机用柠檬酸钠缓冲液（4.4）定容，混匀。有关各组份浓度为50 nmol/mL。
5仪器、设备
5.1实验室用样品粉碎机；
5.2样品筛：孔径0.45mm（40目）；5.3分析天平：感量0.0001g；
5.4喷灯；
5.5旋转蒸发器或浓缩器：可在室温至65℃间调温，控温精度士1℃，真空度可低至3.3×10°Pa(25 mmHg 柱)。
5.6恒温箱或水解炉；
5.7氨基酸自动分析仪要求蛋氨酸砜的分辩率大于90%。6样品
取具代表性的饲料样品，用四分法缩减分取25g左右，粉碎并过0.45mm孔径（40目）筛，充分混匀后装入磨口瓶中备用。
7分析步骤
7.1氧化和水解：称取含蛋白质7.5~～25mg的试样双份（精确至0.0001g，样品量不超过75mg），置于旋转蒸发器20mL浓缩瓶或浓缩管中，于冰水浴中冷却30min后加入已经冷却的过甲酸溶液（4.2）2mL，加液时需将样品全部润湿，但不要摇动，盖好瓶塞，连同冰浴一道置于0℃冰箱中，反应16h。以下步骤依使用不同的氧化终止剂而不同：若以氢溴酸为终止剂，于各管中加入氢溴酸（4.1)0.3mL，振摇，放回冰浴，静置30min，然后移到旋转蒸发器或浓缩器（5.5）上，在60℃C、低于3.3×10°Pa（25mmHg柱）下浓缩至干。用盐酸溶液（4.3.1）约15mL将残渣定量转移到20mL安中，封口，置恒温箱中、110士1℃C下水解22～24h。也可用6.0mol/L盐酸溶液约25ml将残渣转移到50mL消煮管中，于水解炉中、110士3℃下回流水解22~24h。
取出安或水解管，冷却，用水将内容物定量地转移至50mL容量瓶中，定容。充分混匀，过滤，取1～2mL滤液，置旋转蒸发器或浓缩器中，在低于50℃的条件下，减压蒸发至干。加少许水重复蒸干2~3次。准确加入一定体积（2～5mL）的稀释上机用柠檬酸钠缓冲液（4.5)振摇，充分溶解后离心，取_上清211
液供仪器测定用。
GB/T15399—94
若以偏重亚硫酸钠为终止剂，则于样品氧化液中加入偏重亚硫酸钠溶液（4.2.2)0.5ml，充分摇匀后，直接加入盐酸溶液（4.3.2)17.5mL，置110±3℃水解22~24h。取出水解管，冷却，用水将内容物转移到50mL容量瓶中，用氢氧化钠溶液（4.4)中和至pH约2.2，并用稀释上机用缓冲液（4.5)定容，离心，取上清液供仪器测定用。如氨基酸分析受上机样品液中Na+浓度影响，色谱峰出峰时间漂移过大，则需先将水解液定容过滤，而后取2～5mL滤液，于50℃下，减压蒸发至约0.5mL（切勿蒸干），用稀释上机用缓冲液（4.5）将其转移至10mL容量瓶中，加氢氧化钠溶液（4.4）调至pH2.2，并用稀释上机用缓冲液（4.5）定容。混匀，离心，取上清液供仪器测定用。浓缩料测定首先按GB6439测定其NaC1含量。样品处理步骤同上，只是氧化剂使用4.1.2。7.2测定：用混合氨基酸标准工作液（4.9），按仪器说明书，调整仪器的操作参数和（或）洗脱用柠檬酸缓冲液（4.5)的pH，使蛋氨酸砜分辨率达最佳状态（大于或等于90%），注入制备好的样品和氨基酸标准工作液（4.9），进行分析测定。每5个样品（即10个单样）为一组，组间插入混合氮基酸标准工作液（4.9)进行校准。
8分析结果的表述
分析结果表示为胱氮酸和蛋氨酸在样品中的质量百分率，计算公式如下：胱（蛋）氨酸（%）此内容来自标准下载网
X10-6×D×100
式中：A每毫升.上机样品液中胱（蛋）氮酸的含量，ng；m—样品质量，mg；
D-样品稀释倍数。
以两个平行样品测定结果的算术平均值报告结果，保留两位小数。9重复性
两个平行样品测定值的相对偏差，当胱（蛋）氨酸的含量小于0.50%时，不大于5%；大于0.50%时，不大于4%。
附加说明：
本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由中国农业科学院分析测试中心[兼国家饲料质量监督检验中心（北京）、中国农业科学院畜牧研究所和吉林省农业科学院大豆研究所共同起草。本标准主要起草人常碧影、李建凡、张明、闫惠文、左江湾。215
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