本标准规定了蛋白酶制剂的产品分类、要求、试验方法、检验规则和标志、包装、运输、贮存。本标准适用于以淀粉质（或糖质）为原料，经微生物发酵、提纯制得的蛋白酶制剂的生产、检验和销售。本标准不适用于动植物组织提取的蛋白酶制剂，但本标准的技术要求可以参照使用。用作食品添加剂和饲料添加剂的蛋白酶制剂，除本标准的要求外，还需参照其他法规要求。 GB/T 23527-2009 蛋白酶制剂 GB/T23527-2009 标准下载解压密码：www.bzxz.net

ICS 67.220.20
http://foodmate.net中华人民共和国国家标准
GB/T23527—2009
蛋白酶制剂
Protease preparations
2009-04-27 发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2009-1T-01实施
GR/T23527—2009
本标准以QB/T1803--1993上业酶制剂通用试验方法》和QB1805.3—1993《工.业用蛋白酶制剂》为基础定。
本标准的附录B为规范性附录，附录A,附录C和附录D为资料性附录。本标准由中国轻二业联合会提出。本标准由全国食品工业标摊化技术委员会工业发酵分技术委员会归本标准起草单位：诺维信（中国）生物技术有限公司、张家港市金源生物化工有限公司、中国食品发酵工业研究院、山东隆大生物工程有限公司、肇东市日成酶制剂有限公司、邢台新欣翔宇生物工程有限公司、无锡赛德生物二程有限公司、北京东华强盛生物技术有限公司。本标准主要起草人：张品雪、李永其、张蔚、郭庆文、何勇、余波、吴炳炭、曾振宇、钱球、张联。范围
蛋白酶制剂
GB/T23527—2009
本标准规定了蛋白酶制剂的产品分类、要求、试验方法、检验规则和标志、包装、运输、贮存本标准适用于以淀粉质（或糖质）为原料，经微生物发酵、提纯制得的蛋白酶制剂的生产、检验和销停。本标准不适用于动植物组织提取的蛋白酶制剂，但本标准的技术要求可以参照使用。用作食品添加剂和料添加剂的蛋向酶制剂，除标的要求外，还需参照其他法规要求。规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括期误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。CB/T 191包装储运图示标志
GB/T 601化学试剂标推滴定溶液的制备GB2760食品添加剂使用卫生标摊GB/T6003.1金属丝编织网试验筛(GB/T6003.11997,eqvISO3310-1:1990)3术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。3.1
蛋白酶 protease
能切断蛋白质分子内部的肽键，使蛋白质分于变成小分子多肽和氨基酸的酶。3.2
activityof protease
蛋白酶活力
蛋白酶活力以蛋白酶活力单位表,定义为1画休酶粉(或1 mL液体酶），在---定温度和pH值条件下,1 min 水解酪蛋白产生 1 μg酪氨酸,即为 1 个酶活力单位,以 u/g(u/L)表示。4
产品分类
4.1按产品的应用领域
A类产品
B类产品-
食品工业和饲料工业用酶制剂。其他工业用酶制剂。
4.2按产品形态
固体剂型酶制剂和液体剂型酶制剂。4. 3按产品的作用pH值范围
酸性蛋白酶制剂、中性蛋白酶制剂和碱性蛋白酶制剂三种。国内常用蛋白酶制剂的类别、代号与生产菌参见附录A。
5要求
5.1外观要求
固体剂型：白色至黄褐色粉朱或颗粒、无结块，无潮解现象。无异味。有特殊发酵气味GB/T 23527-2009
http：//foodmate.net液体剂型；浅黄色至棕褐色液体，允许有少量凝物。无异味。有特殊发醇气味。5.2理化要求
应符合表1的规定。
表1蛋白酶制剂的理化要求
酶活力/5u/g（或u/rnL)
干燥失重/%
细度[0.40 mm39日标准筛通过率7/%a可按供篇双方合同规定的酶活力规格执行。b不适用于颗粒产品：
5.3卫生要求
应符合国家有关规定。
试验方法
6.1外观
固体剂型
称取样品10g（或10mL），观察、膜闻作出判断，做好记录。6.2酶活力
按附录B进行检测，恒可以参考附录C或附录D进行检测。6.3于燥失重
6.3.1仪器
6.3.1.1电热干燥箱。
6.3.1.2分析天平：精度为C.0001g。6.3.1.3称量瓶：50mm×30muul。6, 3.2 分析步骤
液体剂型
用烘干至恒重的称量瓶称取海样约2g，精确至土0.0002g.置于103℃土2℃电热于燥箱中，将盖取下，侧放在称量瓶旁，烘干2b，取出，加盖，放人干燥器中冷却至室温，称量。6.3.3计算
干燥失重按式(1)计算：
式中：
-样品的干燥失重，%；
干燥前称量瓶加样品的质最，单位为克（g)；干燥后称量瓶加样品的质量，单位为克（g）；称量瓶的质量，单位为克(g）。所得结果表示至·位小数。
6.4细度
6.4.1仪器
6.4.1.1分析天平：精度为0.0001g。6.4.1.2标准筛，00×50—400/250，符合GH/T6003.1的规定。6.4.2分析步
（1）
称取固体酶样10Cg，精确至0.2g。将标推筛装上筛底盘，然后招称好的样品全部转人标谁筛上，2
http：//foodmate.netGB/T 23527—2009
盖，振荡筛分5min（并不时敲打筛帮）：静置2min，取下上盖，小心将筛上物全部转人到已知质最的烧杯巾,用天平称量。
6.4.3计算
细度按式(2)计算：
m3×100
X:—样品的细度,%;
筛上物的质量,单位为克(g)。
所得结果表示至整数。
7检验规则
7.1批次的确定
由牛产单位按照其相应的规则确定产品的批号，批内产品的品质应均7.2取样规则和样本量
7.2.1取样应均勾分布在整个装过程中，或均匀分布于灌装后的成品中。2）
7.2.2取样时应采用适宜的方法保证取样具有代表性保证取样部位和取样瓶的清洁。对用于微生物检验的取样，应使用无菌操作。7.2.3成品抽样的样本量见表2。取样的样本量可按照估计的批量参照表2执行，或由生产企业和（或）相关方确定。批取样量应不小于300g（或300mL），不足按照比例适当加取表 2成品抽样的样本量
批昼/桶或箱
样本堂/桶或袋
注：批基是指批中所包含的单位商品数,单位为桶或箱。样本量是指样本中所包含的样本单位数,单位为桶或接。
7.3＇检验分类
7.3.1出厂检验
7.3.1.1产品出厂前，应由生产厂的质量监督检验部门按本标推规定逐批进行检验，检验合格，并附F质量合格证明的，方可出」
7.3.1.2检验项目：外观、酶活力，干燥失重（固体）、细度（固体)和A类产品的菌落总数。7.3.2型式检验
7.3.2.1检验项目;本标推中全部要求项目，7.3.2.2
般情况下，同-类产品的型式检验每年至少进行一次，有下列情况之一者，亦应进行：原辅材料有较大变化时；
更改关键工艺或设备时；
新试制的产品或正常生产的产品停产3个月后，重新恢复生产时；d
出厂检验与上次型式检验结果有较大差异时；e)
国家质量监督检验机构按有关规定需要抽检时，7.4判定规则
7.4.1出厂检验和()型式检验合格吋，由质量检验部门出其产品合格证，GB/T23527—2009
http：//foodmate.net7.4.2出厂检验和<或)型式检验不合格时，在原批次基础上加倍样分析。如仍不合格，判定该产品为不合格品，不得出厂。
8标志，包装，运输及贮存
8.1标志
8.1.1产品的外包装宜使用符合GB/T 191要求的标志。8.1.2产品的包装上应贴有牢固的标签，标志内容应包括品名、产地、厂名、规格（活力）生产日期、批号或代号、保质期等。
8.2包装
产品的内包装和（或）包装容器的内涂料应采用国家批准的材料，A类产品应符合相应的食品包装用/食品容器卫生标准的材料。
8.3运输
产品在运输过程中应轻拿轻放，严防荫淋和曝晒。运输工具应清洁、无毒、无污染。严禁与有再、有害、有腐蚀性的物质混装混运。8.4贮存
产品应贮存在阴凉下燥的环境下。严禁与有毒、有害、有腐蚀性的物质同存。9保质期
9.1在冷藏（4℃～8℃）条件下，液体酶制剂保质期不少于90天：在25℃下，固体酶制剂保质期不少于180天，企业应按E述要求具体标示。保质期内实测薄活力不应低于标示酶活力。9.2酶制剂是含有年物活性物质的产品。在保质期外，保存期内，酶活力可能降低，但仍具有使用价值。
酸性蛋白酶制剂
中性蛋白酶制剂
碱性蛋白酶制剂
附景A
(资料性附录）
国内常用蛋自酶制剂的类别,代号与生产菌表A.1
国内常用蛋自酶制剂的类别、代号与生产菌生产菌
宇佐美曲薇(Aspergillus usumi,No.537）黑曲(Aspergitlus niger,No,3350)草芽胞杆菌（BucillussubtilisNo.1.398）栖土曲露(Aspergillusterricota,No.3942)放线菌(Actinumyces,No. 16b)
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地衣芽胞杆菌（Baucilluslichenifornis，No.2709）跑衣茅脑杆菌（Bauctllus licheziformis，Na.CW301）短小芽胞杆菌（Bacillus pumitus，No.209）嗜城短小芽胞杆幽（Alkaliphilibucius purmius,Na.SMJ枯草穿胞杆（Bacilusmbhtilis，No.CW302）注：允许在食品工业中使用的蛋白酶制剂的相关婴求参见GH2760。允许在例料工业中使用的蛋白酶制剂的相关要求参见农业部相关公告，
GB/T 23527-2009
B.1原理
http：//foodmate.net附录B
（规范性附录）
蛋白酶活力的测定福林法
蛋白酶在·定的温度与pH条件下，水解酪蛋白底物，产生含有酚基的氨基酸（如：酪氨酸、色氨酸等），在碱性条件下，将福林试剂（Folin)还原，生成铅蓝与钨蓝，用分光光度计于波长680nm下测定溶液的吸光度。酶活力与吸光度成比例，由此可以计算产品的酶括力。B.2仪器和设备
B.2.1分析天平：精度为0.0001g.B.2.2紫外-可见分光光度计。
B,2.3恒温水浴：精度0.2℃。
B.2.4pHI计：精度为0.01pH单位。B.3试剂和溶液
除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂和蒸水或去离了水或相当纯度的水。B.3.1福林(Falin)试剂
于200nL磨口回流装置中加入钨酸钠（NaWO。·2HIO)100.0g、销酸钠（NaMo)2HO)25.0g、水700mL、85%磷酸si0mL、浓盐酸100mL。小火沸腾回流10h,取下回流冷却器，在通风橱中加人硫酸锂（LiSO.）508、水50mL和数滴浓溴水（99%），再微沸15min，以除去多余的溴（冷后仍有绿色需再加溴水，再煮沸除去过量的溴），冷却，加水定容至1000mL。混勾，过滤。制得的试剂应呈金黄色，贮存于棕色瓶内。
B.3.2福林使用溶液
一份福林试剂与两份水混合，摇句。也可使用市售福林溶液配制B.3.3碳酸钠溶液(42. 4/I,)
称取无水碳酸钠(Na2CO:)42.4g，用水溶解并定容至1000mL。B.3.4三氯乙酸(65.4g/L)
称取三氟乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000mL。B.3.5氢氧化钠溶液(20 g/L)
称墩氢氧化钠片剂20.0g，加水900mL并搅拌溶解。待溶液到室温后续水定容至1000mL，搅拌均勾。
B.3.6盐酸溶液：c(HCI)=1mol/L及0.1mol/L按 G3/T 601 配制。
B.3.7缓冲溶液
除以下重自酶的溶解/稀释缓冲体系外，生产名和使用者还可以探讨使用其他适用的缓冲体系。以下各种缓冲游液配制时需用PH计测定并调整PH值，B.3.7.1磷缓冲液(pH=7.5,适用于中性蛋白酶制剂)分别称取磷酸氢二钠(NaHPO.·12H.O)6.02g和磷酸二氢钠(NalIPO4·2H,O)0.5,加水溶解并容至1000 ml。
B.3.7.2乳酸钠缓冲液（pH=3.0,适用于酸性蛋白酶制剂）GB/T23527—2009
取乳酸（80%~~90%)4.71g和乳酸钠（70%)0.89g，加水至900mL，搅拌至均匀。用乳酸或乳酸钠谢整pH到3.0±0.05,定容至1000rml.。B.3.7.3硼酸缓冲溶液(pH=10.5适用于碱性蛋白酶制剂)你硼酸钠9.54g，氢氧化钠1.60g加水900mL，搅拌至均句。用1mol/L盐酸溶液或0.5mol/1氧氧化钠溶液(B.3.5)调整pH=10.5±0.05,定容至1000mL,B.3.8酪蛋白溶液(10.0g/L)
称取标准酪蛋向（NICPBP国家药品标准物质）1.000g，精确到0.001g，用少量氢氧化钠溶液(B.3.5)(若酸性蛋白酶制剂则用浓乳酸2滴～3滴)湿润后，加入相应的缓冲溶液约80mL,在沸水浴中加热煮沸30min，并不时搅拌至醛蛋白全部溶解。冷却到室温后转入100mL容量瓶中，用适宜的pH缓冲溶液稀释至刻度。定容前检查并调整pH至相应缓冲液的规定值，此溶液在冰箱内存，有效期为兰天。使用前重新确认并调整pH值至规定值。不同来源或批号的酪蛋白对试验结果有影响，如使用不同的酪蛋白作为底物，使用前应与以上标准酪蛋白进行结巢比对。
B.3.9L-酪氨酸标准储备溶液（100μg/mL）精确称取预先于105℃干燥至恒重的[-酪氨酸0.1000g0.0002g，用1mol/L盐酸溶液(B.3.6)60 mL溶解后定容至100 ml,即为1mg/mL酪氮酸溶液。吸取1mg/ml.酪氮酸溶液10.00mL，用0.1mol/L盐酸溶液(B.3.6)定容至100mL，即得到100μg/mL的L-酪氨酸标推储备溶液，B.4分析步骤
B.4. 1:标准曲线的绘制
a）L-酪氮酸标准溶液：按表B.1配制。L-酪氮酸稀释液应在稀释后立即进行测定。表 B.1L-氨酸标准溶液
酪氨酸标准裕液的浓度/
(μg/mL)
酪氨酸标准储备溶被(B. 3. 9)的体积/mt
加水的体积/
b）分别取上述溶液各1.00mL（须做平行试验），各加碳酸钠溶液（B.3.3)5.00mL、福林试剂使用溶液(B.3.2)1.00mL，振荡均匀，置于40℃土0.2℃水浴中显色20min取出，用分光光度计于波长680nm，10mm比色Ⅲ，以不含酪氨酸的0管为空白，分别测定其吸光度。以吸光度A为纵坐标,酪氨酸的浓度为横坐标，绘制标准曲线。c）利用回归方程，计算山当吸光度为1时的酪氢酸的量（g）,即为吸光常数K值，其K值应在95～100范围内。如不符合，需重新配制试剂，进行试验。B,4,2样品的测定
B.4.2.1待测酶液的制备
称取酶样品1g～2g，精确至0.0002g。然后用相应的缓冲液溶解并稀释到一定浓度，推荐浓度7
CB/T23527--2009
范围为酶活力10u/tnL～15u/ml
http://foodmate.net对于粉状的样品，可以用相应的缓冲滋充分溶解，然后取滤液（慢速定性滤纸）稀释至适当浓度B. 4. 2.2测定
a）先将酪蛋白溶液放人40℃上0.2℃恒温水浴中，预热5min；b）按下列程序操作：
试管A(空白)
加酶液1.00mL
+40 C±0.2 ℃,2 min
加三氯乙酸2.00mL(摇匀)
+40 c±0.2 C,10 in
加酪蛋白溶波1.00mL(摇勾）
取出静止10ir1，过滤（慢速定性滤纸）+
取 1. 00 mL 滤液
加碳酸钠溶液5.0mL
加福林试剂使用溶液1.00mL
*40 ℃±0.2℃,显色20 min
试管B(酶试样，需作三个平行试样）+
加酶液1.00mL
+10℃±0.2,2min
加酪蛋自溶液1.00mL（摇勺）
+40℃±0.2℃,10 min
加兰氯乙酸 2. 00 mL(摇勺)
取出静止10 min,过滤(慢速定性滤纸)+
取 1. 00 mL 滤液
如碳酸钠溶液 5. 0 mL
加福林试剂使用溶液1.00 mL
40 ℃0. 2 ℃,壶色 20 m
于680m波长，用10m比色血测定吸光度于680nm波长，用10mm比色Ⅲ测定吸光度1.398中性蛋白酶制剂和166中性蛋白酸例剂（鑫见附录A），除反应与显色温度为30℃土0.2℃外，其他操作同上，标准曲线作同样处理。B, 4. 3计算
从标曲线上读山样品晨终稀释液的酶活力，单位为u/mL。样品的酶活力按式（B.1)计算：uAxVX4X×i0
式中：
样品的酶活力，u/gbzxZ.net
由标准曲线得出的样品最终稀释液的活力，u/mL；溶解样品所使用的容量瓶的休积，单位为毫升（mL）；反应试剂的总体积，单位为毫升（mL）；样品的稀释倍数；
-样品的质量，单位为克(g)；
-反应时间 10 min,以 1 min 计。所得结果表示至整数。
B.5精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不应超过平均值的3%。8
C.1原理
附录C
（资料性附录）
蛋白酶活力的測定紫外分光光度法GB/T23527—2009
蛋白在一定的温度与PH条件下，水解酪素酪蛋白成酪氨酸，然后加入三氯乙酸终止酶反应，并沉淀未水解的酪蛋白，滤液中的酪酸对紫外分光光度法在275nm下进行测定。根据吸光度与酶活力的比例关系计算其酶活力。不同的户酶制剂其紫外法结果与福林法结果的换算系数不同：如需要，相关方可根据试验结果统计，确定两个方法的换算系数。C.2仪器和设备
.C.3试剂和溶液
同B,3
C.4分析步骤
C.4.1 求K值
按福林法的表B.1配制不同浓度的L-酪氨酸标准溶液，然后，直接用紫外分光光度计测定其吸光度（A），并计算K值。K值应在130～135范围内，如不符合，需重新配制试剂，进行试验。C.4.2待测酶液的制备
同B.1.2.1。样品稀释液最终的浓度应该在10u/扣L～20i/mL范围之内，C.4.3测定
操作间B.4.2.2中的取液、反应、静止沉淀，直至过滤。滤液用紫外分光光度计，在275nm波长下，测定其吸光度。
注：如结果不平行，可以考虑将加入兰氢乙酸的试样济液返团到水裕中保温30min，然后再测定吸光度。c.5 计算
从标准曲线工读出样品最终稀释液的酶活力，单位为u/mL。样品的活力按式（C.1)计算：X = X.XVXn X8X
式中：
X：样品的活力，u/g；
一出标准曲线得出的样品最终稀释液的酶活力，u/ml溶解样品所使用的容量瓶的体积，单位为毫升（mL）；V
稀释倍数：
-反应试剂的总体积，单位为毫升(mL)；8
一吸取酶液 2.00 mL;
样品的质量,单位为克(g)：
反应时间【omin，以min计。
(C, 1)
GB/T23527—2009
结果保留至整数位。
C.6精密度
http：//foodmate.net在重复性条件下款得的两次独立测定结巢的绝对差值不应超过平均值的3%。10
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