本标准规定了脂肪酶制剂的术语和定义、产品分类、要求、试验方法、检验规则和标志、包装、运输、贮存。本标准适用于以淀粉质(或糖质)为原料，经微生物发酵、提纯制得的中性脂肪酶制剂的生产、检验和销售。 GB/T 23535-2009 脂肪酶制剂 GB/T23535-2009 标准下载解压密码：www.bzxz.net

1CS 67.220. 20
中华人民共和国国家标准
GB/T23535—2009
脂肪酶制剂
Lipase preparations
2009-04-27 发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2009-11-01实施
本标准以QB 1805.4- -1993.1.业用脂肪酶制剂\为基础谢定。本标准的附录A为资料性附录。
本标准由中国轻工业联合会提出，本标准由企国食品业标准化技术委员会工业发酵分技术委员会归口，本标准起草单位：中国食品发酵工业研究院，诺维信（中国）生物技术有限公司本标推主要起草人：张蔚、郑海蜂、郭新光、唐辰、曹振宁、康忆隆。全品球伴网
GB/T23535—2009
1范围
脂肪酶制剂
CB/T23535—2009
本标准规定了脂肪酶制剂的术语和定义，产品分类、要求、试验方法、检验规则和标志、包装、运输、存。
本标准适用于以淀粉质（或糖质）为原料，经微生物发酵、提纯制得的中性脂防酶制剂的生产、检验和销售。
规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注且期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容)或修订版均不适用于木标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可便用这些文件的最新版木。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T191包装储运图示标志（GB/r191—2008,ISO780：1997MOD)GB/T 601化学试剂标准滴定溶液的制备GB/T603化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备（GB/T603—2002,ISO6353-1:1982，NEQ)
3术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。3.1
脂肪酶lipase
能水解H油三酯或脂肪酸酯产生单或双甘油骼和游离脂肪酸，将天然油脂水解为脂肪酸及甘油，同时也能催化酯合成和酯交换反应的酶。3.2
activity of lipase
脂肪酶活力
脂肪酶活力以脂肪酶活力单位表示：定义为1g固体酶粉(或1mL液休酶），在一定温度和pH条件下，1min水解底物产生1μmol的可滴定的脂肪酸，即为1个酶活力单位，以u/g(u/mL)表示。4产品分类
4.1按产品的应用领域
A类产品
B类产品一
食品工业和饲料工业用醉制剂，一其他工业用酶制剂。
4.2按产品形态
固体剂型酶制剂和液体剂酶制剂。5要求
5.1外观
固体剂型白色牟黄褐色粉来或颗粒，无结块、无潮解现象。无异味。有特殊发酵气味。液体剂型：浅黄色至棕褐色液体，允许有少量凝聚物。无异味。有特殊发酵气味。GB/T23535—2009
5.2理化要求
应符合表1的规定，
醇括力\/[u/ml（或u/g)]
干燥失重\/%
表1脂肪酶制剂的理化要求
固体剂型
可按供需双方合同规定的酶括力规格执行。b不适用于颗粒产品。
5.3卫生要求
应符合国家有关规定。
6试验方法
被体剂型
除非另有说明，在分析中权使用分析纯试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。6.1外观
称取样品10(或10 rL)，观察、膜闻作出判断，做好记录，6.2酶活力
6.2. 1原理
脂肪酶在一定条件下，能使甘油三喆水解戒脂肪酸、针油二酯、H油单酯和甘油，所释放的脂肪酸可用标准碱溶液进行中和滴定，用pH计或酚酥指示液指示反应终点，根据消耗的碱量，计算其酶活力。反应式为：
RCOOH + NaOH .. RCOONt +H2O
注1：瞻酶的存在会使检测的脂肪酶的活力增加。蛋白酶的存在会降解脂肪醇，从而使检测到的脂防读的活力减小。
注2：洗涤剂的存在会严重影响本片拨。依不同洗涤剂的类型和浓度不同，这种影响表现为从完全抑制到激活。注3：酶会附着在塑料上，因此应用玻璃器Ⅲ溶解释，同时也应用玻璃器血滴定：在液的转荐中如某时间很短，且选择适当的塑料材质，可以使用塑料移液枪头。6.2.2仪器和设备
6.2.2.1，分光光度计
6. 2. 2. 2
6. 2. 2. 3
6. 2. 2. 4
6. 2. 2. 5
6. 2. 2. 6
6. 2. 2. 7
恒温水浴：精度士0.2℃。
自动移液器。
高速勾浆机，
pH计:精度为 0. 01pH单位。
磁搅拌器。
微量滴定管：10 ml,分刻度≤0.05 mL,6. 2. 3试剂和溶液
6. 2. 3. 1
聚乙烯醇（PVA)：聚合度1750±50,6. 2. 3. 2
橄榄油：试验试剂。
6.2.3.395%（体积分数）艺醇。6.2.3.4
底物溶液
称取聚之烯醇（PVA)（6.2.3.1)40精确至0.1g），加水800mI在沸水浴中加热，搅拌，吉至全部溶解，冷却后定容至1000ml。用于净的双层纱布过滤，取滤液备用。量取上述滤液150mL，加橄榄油50nL，用高速勾浆机处理6min（分两次处理，间隔5min，每2
次处理3 min)，即得乳白色PVA乳化液。该溶液现用现配。GB/T23535--2009
6.2.3.5磷酸缓冲溶液(pII=7.5):分别称取磷酸二氮钾1.96品和十二水磷酸氢二钠39.62,用水溶解并定容到500ml-。如需要，调节落液的pH到7.5土0.05。6.2.3.6氧氧化钠标准溶液c(NaOH）：0.05mal/1.]:按GB/T 601配制与标定。使用时，准确稀释10倍。
6.2.3.7酚致指示液(10g/L)：按GB/T603配制。6.2. 4 分析步骤
6.2.4.1待测酶液的制备
称取酶样品1g-2名，精确至0.0002弓，用磷酸缓冲液（6.2.3.5)溶解并稀释。如果样品为粉状，可用少最磷酸缓冲液溶解后用玻璃棒捣研，然后将上清液小心倾入容量瓶中。若有余残渣，再加少量磷酸缓冲液充分研磨，最终释品全部移入容量瓶中，用磷酸缓冲液定容至刻度，摇匀,转入高速勾浆机组织捣碎机捣研3 min 后供测定。测定时控制酶液浓度，样品与对照消耗碱量之差控制在1mL～2mL范围内。吸瑕样品时，应将酶液摇匀后再取：6. 2. 4.2测定
6.2.4.2.1电位滴定法（第一法）a）按p计便用说明巧进行仪器校正；b）取两个100mL烧杯，十空白杯(A)和样品杯（B）中各加入底物溶液（6.2.3.1)1.00mL和磷酸缓冲液5.00mL，再于^杯中入95%乙醇（6.2.3.3)15.00mL，于40℃士0.2℃水浴中预热5min，然后于A、B杯中各灿待测嗨液1.00mL，立即混勾计时，准确反应15min后，于B杯中立即补加95%乙醇15.00mL终止反应，取出；c）在瓷杯中加人一枚转子，置于电磁搅拌器上，边搅拌，边用氢氧化钠标推溶液（6.2.3.6)滴定，直至pH10.3，为滴庭终点，记录消耗氢氧化钠标准溶液的体积。6.2.4.2.2指示剂滴定法(第二法）a）取两个100ml.三角瓶.分别于空白瓶（A)和样品瓶（B)中各加人底物溶液4.00mL和磷酸缓冲液5.00mL，再于A瓶中加入95%乙醇15.00mL，于10℃士0.2℃水浴中预热$min，然后于A，B瓶中各加待测酶液1.00nL，立即混匀计时，准确反应15min后，于B瓶中立即补划95%乙醇15.0mL终正反应,取出；于空白和样品溶液中各加酚酰指示液两滴，用氢氧化钠标溶液滴定，直至微红色并保持30sb)
不褪色为滴定终点，记录消耗氢氧化钠标推溶被的体积，6.2.4.3计算
脂肪酶制剂的酶活力按式(I)计算：Xi a Vi=Ve)xcx50 ×ni
式中：
Xl样品的活力,u/g；
滴定样品时消耗氢氧化钠标准溶液的体积，单位为毫升（mL）；滴定空白时消耗氛氧化钠标准溶液的体积，单位为升(mL)；氢氧化钠标准溶液浓度，单位为摩尔每升（mol/L)；0:05mol/1氢氧化钠溶液1.00mL相当于脂肪酸50μmol样品的稀释倍数；
氢氧化钠标推溶液浓度换算系数；反应时间15min，以1tnin计。
GB/T 23535—2009
所得结果表示至整数。
6.2.5精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的2%。6.3 干燥失重
6.3.1仪器
6.3.1.1电热F燥箱。www.bzxz.net
6.3.1.2分析天平：精度为0.0001g。6.3.1.3称量瓶：50mm×30mm。
6.3.2分析步骤
用烘干至恒重的称量瓶称取酶样约2g，精确至上0.0002g，置于103℃上2℃电热下燥箱中，将盖取下，侧放在称量瓶旁，烘于2h，取山，灿盖，放人干爆器中冷却至室温。称量。6.3.3计算
干燥失重按式(2)计算:
m-m×100
式中：
样品的干燥失重，%；
-于燥前称量瓶加样品的质量，单位为克(g)：干燥后称量瓶加样品的质量，单位为克（）；称量瓶的质量，单位为克（g）。所得结果表示至一位小数。
检验规则
7.1批次的确定
用生产单位按照其相应的规则负责确定产品的批号，批内产品的品质应均一。7,2取样规则和样本
7.2.1取样应均匀分布在整个灌装过程中，或均勾分布于灌装后的成品中。(2)
7.2.2取样时应采用适宜的方法保证取样具有代表性，保证取样部位和取样瓶的清洁。对用于微牛物检验的取样，应使用无菌操作。7.2.3成品抽样的样本最见表2。取样的样本量可按照估计的批量参照表2执行，或由生产企业和（或)相关方确定。批取样量不得少于300mL(或300g），不足者应按比例适当加瑕。表2成品抽样的样本量
批盘/桶或箱
51~500
样本量/桶或袭
注：批量指批中所包含的单位商品数，单仪为桶或箱。样本量尽指样本中所包含的样木单位数，单位为桶或袋。
7.3检验分类
7.3. 1出厂检验
7.3.1.1产品出厂前，成由生产厂的质量监督检验部门按本标准规定逐批进行检验，检验合格，并附上质量合格证明的，方可出厂。
7.3.1.2检验项月：外观、活J、干燥失重（围体)和A类产品的菌落总数。7.3.2型式检验
7.3.2.1检验项目：本标准中全部要求项目。GB/T 23535—2009
7.3.2.2一般情况下，同一类产品的型式检验每年至少进行-次，有下列情况之一者，办应进行：a）原辅材料有较大变化时；
b）更改关键工艺或设备时；
c）新试制的产品或正常生产的产品停产3个H后，重新谈复生产时；d）出厂检验与上次型式检验结果有较大差异时；e）国家质量监督检验机构按有关规定需要抽检时。7.4判定规则
7.4.1出厂检验和(或>型式检验合格时，由质量检验部门出具产品合格证。7.4.2出厂检验和(或)型式检验不合格时，在原批次基醋上加倍取样分析。如仍不合格，判定该产品为不合格品，个得出」。
8标志、包装、运输及贮存
8.1标志
8.1.1产品的外包装宜使用符合（I3/T191要求的标志。8.1.2产品的包装上应贴有牢固的标签。标志内容应包括品名、产地、厂名、规格（活力）、步产日期、批号或代号、保质期等。
8.2包装
产品的内包装和（或）包装容器的内涂料应采用国家批准的材料，A类产品应符合相应的食品包装用/食品容器卫生标推的材料。
8.3运输
产品在运输过程中应轻拿轻放，严防雨琳和曝晒。运输工具应清洁、无毒、无污染。严禁与有毒、有害、有腐蚀性的物质混装混运。8.4购存
产品应贮存在阴凉干燥的环境下。严禁与有萨、有害、有腐蚀性的物质同存。9保质期
9.1在冷藏4℃~8℃条件下，液体酶制剂保质期不少于90天，在25℃下，固体酶制剂保质期不少于180天，企业应按上述要求具体标示。保质期内实酶活力不应低于标示酶活力。9.2制剂是含有生物活性物质的产品。在保质期外，保存期内，酶活力可能降低，但仍具有使用价值。
GB/T23535—2009
A.1范围
附录度
（资料性附录）
动态滴定法测定脂肪酶的酶活力本方法适用于测定含有或混有脂肪酶/酯酶样品中的脂肪酶活力特殊的脂肪酶或特殊的成品制剂在样品制备阶段需采用特殊的稳定或抽提于段以保证检测到所有的脂肪酶活力。
A.2原理
脂肪酶水解甘油三酯牛成脂肪酸，使反应体系的pH不断下降。通过连续加入碱的方法保持反应体系的pII恒延。碱滴定的速率与酶活力成比例。注1：脂酶的存衣会使检测的脂肪酶的活力增加。蛋白避的存在会降解脂肪酶，从而使检测到的脂肪酶的活力减小。注2：洗涤剂的存衣会严重影响本方法。被不同洗涤剂的类型和浓度不同，这种影响表现为从完全却制到激活。注3：酶会附着在塑料上，四此应用玻璃器且溶解稀释，同时也应用玻璃器Ⅱ滴定，在溶液的转移中如果时间很短，且选择适当的塑料材质，可以使用塑料移液枪头A.2.1反应式
HCOU-CHCHCH
HCOOC-CHCH,CH
H,COOC-CH,CH,CH
主丁酸甘油酯
A.2.2反应条件
温度：30℃±1℃。
崩妨酶
底物浓度：0.16mol/L的三丁酸甘油酯。CHOH
HCOOC-CCH,CH, + CHCHCHCOOH
ELCOOC-CILCH,CET,
二丁酸甘油酯
反应时间：全少1.5min（只有线性反应区用丁计算斜率）。A.2.3分析范围
样品的分析范围是0.2u/mL～1.0u/mL。如果可能，所有样品应在1.5u/mL～4.0u/mL的范围内被分析。
A. 2. 4检测限
对于液体样站检测限为20u/g，相当于2.5g样品溶解在10mL溶液中，然后再稀释25倍。对于固体样鼎检测限为50u/g，租当于1.0烹样品溶解在10mL溶液中，然后再稀释25倍。A.3仪器和设备
A.3.1具有动态滴定（pH-1.al)功能的滴定仪。在动态滴定仪中还要注意选择适当的pII电极（对pH值响应快）和滴定分配样品准确（特别是滴定氢氧化钠）。还要选摔玻璃滴定容器（带水浴夹套）和有效的搅拌器（棒状螺旋搅拌器优丁磁力搅拌），这样才构成完整的系统：A.3.2乳化器。
A.3.3恒温水浴：精度10.2℃。
A.3.4温度计：精度土0.2℃。
A.3.5自动移液器。
A.4试剂
GB/T 23535--2009
除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。A.4.1三」酸甘油醋(CrHO）。
A, 4.2氯化钠(NaCI)。
A,4.3磷酸二氢钾(KH,PO）
A.4.4阿拉伯胶
A.4.5甘氨酸(HNCH,CO0II)。
A.4.6甘油[HOCH,CH(OH)CH,OH,
氢氧化钠片剂(NaOH)
A,4.8电极校止液(pH 7.0)。
电极校正液（pH4.01)。
A,4. 10 96%乙醇。
A,4.1t氮气(N,)。
A.4.12氢氧化钠溶液[c(NaOII)=1mal/L]：按照GB/T601配制。氢氧化钠滴定液[c（NaOH)=0.025mol/LJ：取上述溶液23ml,用水稀释并定容到A.4.13
1 000 mlg
配好后需用适宜的设备脱气。
A.4.14氢气化钠滴定液Lc(NaOH).=0.005mol/Li：取氢氧化钠滴定液（A.4.13)25tnL，用水稀释并定容到 5 000 mL,
A.4.15乳化剂：分别称取阿拉伯胶30.0g、氯化钠53.7g和磷酸二氢钾1.20g.量取廿油1 620 ml..
将大约180mL去离水倒入400mL的烧杯中，加入搅拌子，开始高速搅拌，将阿拉伯胶缓慢倒入水巾，不断搅拌直至全部溶解。将称好的氟化钠和磷酸一氢钾转入到3L容量瓶中，加350mL水充分搅拌直至完全溶解，将甘油全部加入。将阿拉伯胶溶液转入容量瓶中，充分搅拌后用水定容。A.4.16底物乳剂：称取三丁酸甘油酯62.5g，分别量取乳化剂（A，4.15)200mL和水940ml，混合。将混合液匀浆器处押3min(700r/min）。勾浆后的溶液先用普通的磁力搅拌揽拌至少20min，然后调节 pH 到 4. 75±0. 05。
不同来源和批号的三丁酸H油酯和阿拉伯胶对试验结果有影响，在更换产品或批号前需进行有效性确认。
A.4.17甘氨酸缓冲液1(7.51/1.）：称取甘氨酸37.54名和氧氧化钠片剂18.5名，用水溶解并定容到5L，如需要，谢节溶液的pH到10.8士0.05。A.4.18甘氢酸缓冲液2(0.75g/L）：取100mL上述甘氢酸缓冲液1,用水定容到1000mL。如需要，调节溶液的 pH到 10.8±0.05,
A.5标准曲线和样品处理
A.5. 1 标准曲线
称取一定量的巴知活力标准品，精确到0.0001么。然后用甘氨酸缓冲液2（A.4.18)溶解并稀释，制成标准储备液，标准储备液的浓度为20u/mL，然后按照表A.1配制溶液，并绘制标准谢线。GB/T23535—2009
标准点
A,5.2标准对照
表A.1标准曲线
脂肪酶活力/
(u/mL)
标推储备所用体积/
可使用已知活力的样品作为标准对照。标准对照的处理同样品。A, 5. 3 样品处理
不同的样品需做不同的预处理，以激活或保护在样品基质中的脂肪酶。用水定容至/
可考虑采用廿氨酸缓冲液1(A.1.17)和水来分别溶解和稀释样品的方法，或廿氨酸缓冲液2来溶解和稀释样品的方法，或直接用水溶解和稀释样品的方法，以求得到最好的效果。样品的溶解液和稀释液应充分搅拌均勾。
样品应最终释到嗨活力在1.5u/mL~4.0u/ml.范围内，如可能，样品稀释完应立即测定。A. 6 分析步骤
A.6.1系统准备
按照无水乙醇、适当的肥皂水、热水.去离子水、底物的顺序清洗滴定容器和管路。保证水浴的温度在30. 0 ℃±0,5 ℃。校正pH电极：每天使用前要校正pH电极的灵敏度在95%~~102%：PH7.00应在6.985~6.989之间；pH4.01应在4.009~4.012之间。如果达不到此标准，按照pH电极使用说明进行冲洗并再次校正。
A.6.2分析
pH电极用后浸泡在饱和的氯化钾(KCI)溶液中，使用前冲洗。在反应溶液表面用氮气吹充，以防止空气中二氧化碳的干扰。分析前一定要保证底物的温度为30.0℃±0.5℃。
在分析每个样品前要用0.005mol/L的氢氧化钠溶液（A.4.14)冲洗滴定Ⅲ和管路。试验步骤如下：
--将15mL的底物加入到滴定Ⅲ中。滴定前pII电极的读数应小乎7.0。-加1mL样品稀释液加人到滴定血中。反应体系的pII在滴定过程中保持在7.0。记录为保持值定PH而加1人的滴定液的量。滴定结束后滴定仪打印出滴定曲线线性范围的平均斜案（如果使用不同的设备，数据可能以其他形式输出）。滴定断线应有段持续1.5min的线性输出。先分析标准曲线（每个标准点分析1次），然后分析-个标准对照，再分析样品（每个样品分析1次）。重要的是一大之中非-次运行的样品不能使用相同的标难曲线。事先应知道每一次运行的样品的个数。如果样品在当大晚些时候分析，标谁溶液要重新分析。每个样品分析前和最后“个样品完成分析后，系统将进行冲洗。排空底物容器利管路，并用乙醇冲洗。如果系统将会在1周以上时间不再使用，则需要用去离子水进行冲洗并用氮氧化钠R
溶液（A.4.14）或相匝浓度的盐溶液充满缴感部件：避免出现盐奖结晶：A.7计算
A,7. 1 结果计算
CB/T 23535--2009
利用标准点的测定值作标准曲线,其中X轴为标准品酶活力,Y轴为相应的滴定反应的平均斜率（mL/min）。标准曲线应该是条自线。样品稀释液的活力从标准曲线中读出，然后按式（A.1)计算：X,=AxV,Xn2
式中：
-样品的酶活力，u/g；
A——稀释样品在标准曲线上读出的酶活力，u/mL；V\：样品溶解用的容量瓶体积,单位为毫升（riL）n
第二欣稀释的倍数：
样品的质量，单位为克（g）。
A.7.2结果的确认
当满足以下条件时可以确认本次分析有效：标准对照的检测值在本方法所规定的可接受偏差范围内；(A.1)
标准曲线的斜率应满足：1)标准点1小于0.02mL/min；2)标准点6在0.14mL/min~0,18 mL/min之间;
标曲线的相关系数(-2)人于等于0.995；标准点3～点6的相关系数（r)应大于0.9995，标准点1～2的人于0.995是可接受的。如果达不到此条件，应检查分析系统。A7.3结果的表示
结果给出3位有效数字。如果结果低于检测限，则表示为20u/g（液体）或50u/g（固体）。A.8精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的5%。9
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国家标
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