本标准规定了莲蓉制品中芸豆成分的定性PCR检测方法。本标准适用于由莲蓉制品半成品和成品中芸豆成分的定性检测。本标准的检出限为0.5 ng 芸豆DNA。 GB/T 23814-2009 莲蓉制品中芸豆成分定性PCR检测方法 GB/T23814-2009 标准下载解压密码：www.bzxz.net

ICS 67.050
中华人民共和国国家标准
GB/T23814—2009
莲蓉制品中芸豆成分定性PCR检测方法Protocol of the polymerase chain reaction fordetecting kidney beans components in lotus foods2009-05-27发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局数码防伪
中国国家标准化管理委员会
2009-09-01实施
本标准的附录A为资料性附录。
本标准由中国标推化研究院提出并归口。GB/T 23814--2009
本标准负责起草单位：国家加工食品质量监督检验中心（广州）、广州市质监督检测研究院，中华人民共和国操圳出人境检验检疫局。本标准主要起草人：萘依军、覃芳芳、罗海英、邓鸿铃、郭新东、吴玉盔、蓝芳。1
http：//wwwfoodmate，net1范围
莲蓉制品中芸豆成分定性PCR检测方法本标准规定了连蓉制品中芸豆成分的定性PCR检测方法。本标准适用于由莲馨制品半成品和成品中芸豆成分的定性检测。本标准的检出限为 0. 5 ng 芸豆 DNA。2规范性引用文件
GB/T23814—2009
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682-2008,IS03696.1987,MOD）GB/T19495.1转基因产品检测通用要求和定义GB/T19495.2转基因产品检测
实验室技术要求
GB/T19495.7
转基固产品检测抽样和制样方法3术语和定义
GB/T19495.1确立的术语和定义适用于本标准。4防污染措施
检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T19495.2中的规定执行。5抽样和制样
按照 GB/T19195.7规定的方法执行。6测定方法
6.1原理
样品经DNA提取后，针对芸豆特异基因序列设计引物，通过 PCR技术，特异性扩增芸豆基因的DNA片段,根据 PCR扩增结果，判断该样品中是否含有芸豆成分。6.2试剂和材料
除另有规定外，所用试剂为分析纯或生化试剂,水为按照GB/T 6682规定的一级水。6.2.1
引物：检测莲蓉制品内源基因和芸豆特异基因的引物及其信息见表1。表1莲蓉制品内、外源基因所需的引物信息检测基因
NNEA0732
AB070627
引物序列
正5\-GTAGAATCGGCACTGGAGCTAG-\反：5\-CATGGGCTAACCAACTAGACAGC-3*正：5’CAGACATTTCATATCCAGGGAGG-3\反:5*-TGAATTGTACGGTGAAGGATGG-2*+4
PCR产物大小/
基因性质
莲子特异基因
芸豆特异基因
适用范围
莲蓉制品
遵著制品
GB/T 23814--2009
琼脂糖：电冰纯。
Tris饱和酸
三氯甲烧，
冰乙酸，
无水乙醇。
异茂醇，
异丙醇。
氢氧化钠（NaOH)。
盐酸（HCD)。
三羟甲基氨基甲烷（TH）
乙二胺四乙酸盐（NaEDTA）
蔗糖。
溴蓝。
乙酸钠（NaA）
苯酚十三额甲烧
异成醇（25+24+1-体比）
享（24+
体积比店
三氯甲烷
3 mol/l
.3mol/1
艺酸销溶液艺酸调书H为52
电泳缓冲液：
1×TAE
CHaOH调节
NaEDTA,用 H
TE缓酒
PCR试
上样缓
1AE(212 Tr571mL冰ZA10e mL 0,5 mo)/L.0，定容至11按比例稀释。
NaETAo.001moL/用HCI或NaOH调节pII垒8.o.is 0. 01 mol/l.
Taq酶，dNTP.oXBuffer氯化钱（Mg35%浪酸蓝+40%（砸量浓度）能糖落液溴化乙售浴液：1mg/ml.
70%乙配
等效DN
试剂盒。
DNA分子标准品（506）
6.3主要仪器
PCR热循环仪
电泳仪。
凝胶成像系统。
离心机：12000/mim
涡旋振荡器。
分析天平.0.1g。
微量可调移液器：0.5u，2μ1090100，200μ，1000μl核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。6.4检测步骤
模板INA的提取
6.4. 1. 1对照设置
阳性对照：莲子基因组DNA，芸豆基固组DNA：阴性对照：已知以不含该基因的样品提取的DNA；空白对照：双蒸水（ddH，0)。
6.4.1.2DNA提取步骤
样品DNA提取时设双平行：
trHk伙[网httn://wwwfoodmate.netGB/T 238142009
将样品粉碎，取适最样品，加入400uLTE缓冲液（6.2.20)，将沉淀完全溶解：b
加人与溶液等体积苯酚+三氯甲烷+异戊醇（25+24+1)（6.2.16)，重复混勺10nin:12000r/min室温离心10min，将上清液转移至另一千净的1,5tmL离心管中；t
加入与上清液等体积三氯甲烧+异戊醇（24+1)(6.2.17)，重复混匀10min;12000r/min室温离心10min，小心吸胶上清液；加人上清液1/10体积3mo1/L乙酸钠（6.2.18），加人2倍~2.5倍体积经-20℃顶冷的无水乙醇（6.2.6),颠倒混勺后一20℃静置1h;或加人等体积异丙醇（6.2.8.混勾后室温静置10min;
15000r/min，室温离心omin，弃去上清液，70%醇（6.2.24）洗涤沉淀2次
50 L 0.1X TF0
3次，燥DNA；
220)落解沉淀4C保存。
可以用等效DN遇取剂盒（6.2.25)提取样品DNA，按品剂盒操作说明书指示操作。6. 4. 2 DNA 质量的测定
样品中提取的质量的激定用核酸蛋自分析仪或紫外分光光度计（6.38）进行测定。
取适量DNA客波加TE缓中液（6:2.20）进260nm利280m门吸光值4和4Www.bzxZ.net
稀释·用核酸蛋
自分析仅或紫外分光光度计分别检测的浓康按式（1算：
AXNX 50/1 000
C---DNAO-μg/uL;
260的吸光值：
N核酸释音数。
当A/A比值在1.4以上时可用于PCR扩增6. 4. 3 PCR 扩增
6. 4. 3. 1 PCR D体系
检测样品内
20间时，PCR广增数果好，
每个应体系应设置再个平行反应。同时设置阳源基因的POR反童体系见表2
性对照、阴性对照和对照。
K反应体系
试剂名称
10X PCRBuffer
Primers
Teruplate
delH,o
贮备液浓度
asmmol/L
2. 5 musl/ L
2 pnol/μL
C. 1 μg/μL--0. 2 μg/μL
6.4.3.2PCR反应循环参数
别表3。
trHk伙[网httn://wwwfoodmate.net如PCR良应体系的体积/
正：0.25
反：0.25
补足反应体系总体积为25
GB/T23814—2009
莲子特异基因
芸豆内源基因
表3各基因检测PCR反应条件
94 C/5 min
94 ℃/5 min
6.4.4PCR扩增产物电泳检测
94 ℃/30 s
58 ℃/30 s
72 ℃/30 s
94 ℃/30 9
56 /30 5
72 C/30 s
循环数
后延伸
72 C/5 min
72 ℃/5 min
将适量的琼糖(6.2. 2)加入 1×TAE缓冲液(6. 2. 19)中,配制成浓度为 2%(质量浓度)的溶液加热溶解，然后加人漠化乙锭溶液（6.2.23)至终浓度0.5产名/mL，混匀，稍适冷却后，倒人电泳板上，插上梳板，室温下凝固后，放入盛1XTAE缓冲液的电泳槽中，轻轻垂直向上拔去梳板。在每个泳道中加人适量的PCR产物与上样缓冲液(6.2.22)的混合液(10μL~20μLPCR产物与上样缓冲液2μL混合)其中一个泳道中加人DNA分子质量标推品(6.2.26)5 μL，接通电源电泳，按2 V/c的电压电泳至蓝证移至3cm--5Cm处结束。凝胶成像仪观察并分析记录。6. 4. 5结果分析
6. 4.5. 1莲著内源基因的检测
用针对连蓉内源基因设计的引物对样品DNA提取液进行PCR扩增，阳性对照和待测样品均应被护增出142bp的PCR产物，限性对照和空白对照施不能扩增得到相应的PCR产物。如待测样品未见有该 PCR扩增产物,则说明 DNA提取质量有问题,或 DNA提取液中有抑制 PCR反应的因子存在,应重新提取DNA，真到扩增出该PCR产物。6.4.5.2芸豆基因的检测
对样品DNA进行芸豆内源基因的PCR扩增，如果阴性对照和空白对照未出现扩增条带，阳性对照和待测样品均出现预期大小的扩增条带（扩增片段大小194bp），刚可初步判定待测样品中含有可疑的芸互豆成分，应进一-步进行确证实验，依据确证实验的结果最终报告，如果待测样品未出现PCR扩增产物，则可断定待测样品中不含有芸豆成分。6.4.6确证实验
当PCR检测结果为阳性时，可通过酶切的方法或其他方法（如测序比对，序列参见附录A)进行确证：
PCR产物的限制性内切酶酶切分析；用内切酶Apal对PCR扩增产物进行酶切分析，阳性样品酶切片段大小为81 bp和103bp。推荐酶切体系为50μL,PCR扩增产物20μL，酶用为2U,酶切温度和时间为37℃30min，电泳方法参见6.4.4。
7结果表述
7.1芸豆特异基因片段得到扩增，且扩增升段大小与预期片段大小一致，表明样品中检视出芸豆戒分，结果表述为“样品中检测出芸豆成分，阴性对照、阳性对照及空白对照检测结果正常\。7.2莲蓉内源基因片段得到扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，而芸豆特异基因片段未得到扩增，或扩增片段大小与预期片段大小不一致，表明样品中未检测出芸豆成分，结果表述为“样品中未检测出芸豆成分，阴性对照、阳性对照及空白对照检测结果正常”。4
A.1芸豆特异基因扩增序列(194 bp）附录A
（资料性附录）
扩增片段序列
GB/T23814—2009
CAGACATTTC ATATCCAGGG AGGAACATGC TATTCGTTTG GCGAAGACTATGGACGATCA GAATTAAAGG GTGGTGGGGC CCATAAGTTT GATCAGCATGCTGTTTGGAC TGTAAACAAA CACAGGTAGC AGCATCACTC GCAGTCTCGTTGTCACCTCC ACGCAGATAG CGCCATCCTT CACCGTACAA TTCAA.2莲子特异基因扩增序列(142 bp)GTAGAATCGG CACTGGAGGT AGCCGGCCAG GTGGCAGGTA CATCAGTATCAACCTCACCC CTTCCGTATA GTGCCATGGC AAGCCAATGT GAGGCCCTAGGCACAGGAAC AAGGAAGAAG CTGICTAGTT GGTTAGCCCA TG合国httn·//wwwfoodmate.net
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