本标准规定了猪肉制品中植物成分的定性PCR检测方法。本标准适用于由猪肉制成的半成品和成品中植物成分的定性检测。本标准的检出限为0.5 ng 植物DNA。 GB/T 23815-2009 猪肉制品中植物成分定性PCR检测方法 GB/T23815-2009 标准下载解压密码：www.bzxz.net

ICS67.050
中华人民共和国国家标准
GB/T23815—2009
猪肉制品中植物成分定性PCR检测方法Protocol of the polymerase chain reaction for detecting plant components in meat2009-05-27发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局数码防伤
中国国家标准化管理委员会
2009-09-01实施
本标准的附录A为资料性附录。
本标准由中国标准化研究院提出并归口。GB/T23815—2009
本标准负责起草单位：国家加工食品质量监督检验中心（广州）、广州市质量监督检测研究院、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局。本标准主要起草人：郭新东、邓鸿铃、草芳芳、罗海英、衰洁、吴玉銮、谢文。品伙伴网http://foodmate.net1范围
猪肉制品中植物成分定性PCR检测方法本标推规定了猪肉制品中植物成分的定性 PCR检测方法。本标准适用于由猪肉制成的半成品和成品中植物成分的定性检测。本标准的检出限为 0. 5 ng植物 DNA。2规范性引用文件
GB/T 23815—2009
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682—2008,ISO3696：1987，MOD）GB/T19495.1转基因产品检测通用要求和定义GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求GB/T19495.7转基因产品检测抽样和制样方法3术语和定义
GB/T19495.1确立的术语和定义适用于本标准。4防污染措施
检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T19495.2中的规定执行。5插样和制样
按照GB/T19495.7规定的方法执行。6测定方法
6.1原理
样品经过提取DNA后，针对植物特异基因的序列设计引物，通过PCR技术，特异性扩增植物基因的DNA片段，根据PCR扩增结果，判断该样品中是否含有植物成分6.2试剂和材料
除另有规定外，所用试剂为分析纯或生化试剂，水为按照GB/T6682规定的一级水。6.2.1引物：检测猪肉制品内源和外源基因的引物及其信息见表1。表1猪肉制品内、外源基因所需的引物信息检测基因
tRNALeu
mitochondrian
引物序列
正：5\-CGAAATCGGTAGACGCTACG-3*反：5\-TTCCATTGAGTCICTGCACCT-3\5\-AAGTTAGAGATCGGGAGCCTAA-35'-AAGGTGACAATAGGTAGTCC-3
PCR产物大小/
基因性质
植物叶绿体
猪内源线粒体基斑
适用范圃
猪肉制品
猪肉制品
GB/T238152009
6.2.2琼脂糖：电泳纯。
6.2.3Tris饱和酚。
6.2.4三氯甲烷。
6.2.5冰乙酸。
6.2.6无水乙醇
异戊醇。
异丙醇。
氢氧化钠（NaOH）。
盐酸（HCD
三羟甲基氨基甲烷（Tris
乙二胺四乙酸钠盐NaEDTA
蕉糖。
溴酚蓝。
Z酸钠NaA
异戊醇（25千24十1.体积比）
苯酚十三氟
用烷子
伐停（24+
体积比）
三氯甲烷
乙酸钠溶
mol/L乙酸钠溶液，乙
酸调节PH为5.2.
永缓冲液：
敢50X
TAE(242gTns.571
mL冰乙酸，100ml0.5mol/L
N&EDTA,用HO
aOH调节
.0，定容至11）按比例稀释。
lis0.01mal/LNaDTA.0.001mol/L用HCl或NaO调pH至8.0。6.2.20
TE缓冲
PCR试产
Tag酶，dNTPs.10×Buffer，氯化镁（MgCl）.25%溴酚蓝：10%（质量浓度）蔗糖溶液上样缓
溴化乙镜浴液：1mg/mL
70%乙醇
等效DN
取试剂盒：
DNA分子
主要仪器
PCR热循环仪
电泳仪。
凝胶成像系统。
标准品（50bp）
离心机：12000/mm
涡旋振荡器。
分析天平：0.1g。
微量可调移液器：0.5μ2，10，20100200g，1000μ核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。6.4检测步骤
6.4.1模板DNA的提取
6.4.1.1对照
阳性对照：猪基因组DNA、植物基因组DNA；阴性对照：已知以不含该基因的样品提取的DNA；空白对照：双蒸水（ddH.O)。
6.4.1.2提取步骤
a）样品DNA提取时设双平行：
wh++n:
GB/T23815—2009
将样品粉碎，取适量样品放入2.0mL离心管，加人400uLTE缓冲液（6.2.20），于65℃水浴b
中溶解10min，上下颠倒混匀；
加与溶液等体积苯酚十三氯甲烷+异戊醇（25+24+1)（6.2.16）.摇晃混勺10min12000r/min室温离心10min，将上清液转移至另一干净的1.5mL离心管中；d
加人上清液等体积三氯甲烷+异戊醇（24+1)（6.2.17），摇晃混匀10min；e
12000r/min室温离心10min，小心吸取上清液；D
加上清液1/10体积乙酸钠溶液（6.2.18）2倍～2.5倍体积经一20℃预冷的无水乙醇g）
（6.2.6），颠倒混匀后一20℃静置1h；或加人等体和异丙醇（6.2.8），混勾后室温静置10min；h）12000r/min室温离心romin，奔去上清液；D70%乙醇（6.2.24）洗涤沉淀2次~3次，干燥DNA）50μL0.1×TE6.220落解沉淀，4℃保存。也可以用等效DNA提取式剂盒（6.2.25)提取DNA，按试剂盒操作说明书指示进行操作。6.4.2DNA质量的测定
样品中提取的DNA质量的测定用核酸蛋百分析仪或紫外分光加TE缓中液（6.2.20）进
取适量DNA
260nm和280nm处的吸光值A品和AS
式中：
DNAug/μ；
品的吸光值：
核酸择音数。
光光度计（6.3.8）进行测定。
稀释用核酸蛋
1分析仪或紫列分光光度计分别检测算：
DNA的浓度按式
AXNX50/
当A250/A2，比值在1.4以上时可用于PCK扩增，16.4.3PCR扩增D
6.4.3.1PCR反应体系
检测肉制品内
PR反应体系
基因的
阳性对照、阴性对照和
试剂名称
10XPCRBuffer
Primers
Template
贮备液浓度
25mmol/1
2.5mmol/l
20pmol/μL
5U/μL
PCR反应体系
0. 1 μg /μL~0.2 μg /μl
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间时，PCR扩增效果好。
体系应设置两平行反应。同时设置加入PCR反应体系的体积/
正：0.25
反：0.25
补足反应体系总体积为25
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6.4.3.2PCR反应循环参数
见表3。
植物叶绿体
tRNALeu基因
猪内源基因
表3各基因检测PCR反应条件
94 C/30 s
94 C/5 tmin
94 tC/5 min
6.4.4PCR扩增产物电检
60 C/30 8
72 0/30 8
94 ℃/30 s
54 /30 sbZxz.net
72 /30 s
循环数
后延伸
72 C/5 min
72 ℃/5 min
将适量的琼脂糖(6.2.2)加入1×TAE缓冲液(6.2.19)中，配制成浓度为2%（质量浓度）的溶液，加热溶解，然后加人溴化乙锭溶液（6.2.23）至终浓度0.5μg/mL，混匀，稍适冷却后，倒人电泳板上，插上梳板，室温下凝固后，放入盛1×TAE缓冲液的电泳槽中，轻轻垂直向上拨去梳板。在每个泳道中加人适量的PCR产物与上样缓冲液(6.2.22)的混合液(10uL~20μLPCR产物与上样缓冲液2μL混合），其中一个泳道中加入DNA分子质量标准品（6.2.26)5μL，接通电源电泳，按2V/cm的电压电泳至漠酚蓝迁移至3cm～5cm处结束。凝胶成像仪观察并分析记录。6.4.5结果分析
6.4.5.1内源基因的检测
用针对猪内源基因设计的引物对样品DNA提取液进行PCR测试，以猪肉DNA为阳性对照，阳性对照和待测样品均应被扩增出264bp的PCR产物。如末见有该PCR扩增产物.则说明DNA提取质量有问题，或DNA提取液中有抑制PCR反应的因子存在，应重新提取DNA，直到扩增出该PCR产物。6.4.5.2植物基因的检测
对样品DNA提取液进行植物特异基因的PCR测试，以植物DNA作为阳性对照，如果阴性对照和空白对照未出现扩增条带，阳性对照和待测样品出现预期大小的扩增条带（扩增片段大小为193bp），则可初步判定待测样品中含有可疑的植物成分，应进一步进行确证实验，依据确证实验的结果最终报告；如果待测样品米出现PCR扩增产物、则可断定待测样品中不含有植物成分。6.4.6确证实验
当PCR检测结果为阳性时，可通过实时荧光PCR方法或其他方法（如测序比对，序列参见附录A)进行确证试验；
推荐实时荧光PCR探针序列5-GCAATCCTGAGCCAAATCC-3*7结果表述
7.1植物特异基因片段得到扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，表明样品中检测出植物成分，结果表述为“样品中检测出植物成分，阴性对照、阳性对照及空白对照检测结果正常”，7.2猪内源基因片段得到扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，而植物特异基因片段未得到扩增，或扩增片段大小与预期片段大小不一致，表明样品中未检测出植物成分，结果表述为“样品中末检测出植物成分，阴性对照、阳性对照及空白对照检测结果正常”。4
附录A
(资料性附)
扩增片段序列
A, 1植物时绿体 tRNALen 基因片段(193 bp)GB/T 23815—2009
CGAAATCGGT AGACGCTACG GACTTAATTG GATTGAGCCT TAGTATGGAAACTTACTAAG TGATAACTTT CAAATTCAGA GAAACCCAGG AATTAAAAATGGGCAATCCT GAGCCAAATC CTCTTCTCCT TTCCAAGAAC AAACAGGGGTTCAGAAAGCG AAAAAGGGGG ATAGGTGCAG AGACTCAATG GAAA.2mlitochondrfon基因片段(264bp)）AAGTTAGAGA TCGGGAGCCT AAATCTCCCC TCAATGGTAT GCCACAACTAGATACATCCA CATGATTCAT TACAATTACA TCAATAATTA TAACATTATTTATTTTATTC CAACTAAAAA TCTCAAACTA CTCATACCCA GCAAGCCCAGAATCAATTGA ACTCAAAACT CAAAAACATA GCACCCCTTG AGAAATAAAATGAACGAAAA TCTATTTGCC TCTTTTATTG CCCCCACGAT AATAGGACTACCTATTGTCA CCTT
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