标准规定了工业循环冷却水中土壤真菌的测定方法。适用于工业循环冷却水中土壤真菌的测定，也适用于原水、生活用水及其他水中土壤真菌的测定。 GB/T 14643.4-2009 工业循环冷却水中菌藻的测定方法 第4部分：土壤真菌的测定 平皿计数法 GB/T14643.4-2009 标准下载解压密码：www.bzxz.net

ICs 71. 040. 40
中华人民共和国国家标准
GB/T14643.4--2009
代替 GB/T14643.41993
工业循环冷却水中菌藻的测定方法第4部分：土壤真菌的测定
平Ⅲ计数法
Examination of bacteria and algae in industrial circulating cooling waler-Part 4.Examination of soil fangi--Standard of plate count2009-05-18发布wwW.bzxz.Net
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2010-02-01实施
GB/T14643《.1.此循环冷却水中菌的测定方法》分为以下几个部分：第］部分：黏液形成菌的测定平血计数法第2部分：上壤菌群的测定平正计数法第3部分：黏泥真菌的测定平血计数法-第4部分：十壤真菌的测定平Ⅲ计数法：第5部分：硫酸盐还原菌的测定MPN法第6部分：铁细菌的测定MPN法
本部分为GB/T14643的第1部分：GB/T14643.4—2009
本部分代替GB/T14643.41993工业循环冷却水中十壤真菌的测定平瓜计数法》。本部分与G13/T14643.4—1993相比，在技术内容上并无变化，只是对文本结构和文字进行了修改。
本部分由中国有油和化学T业协会提出：本部分山全国化学标准化技术委员会水处理剂分会（SAC/TC63/SC5)归口。本部分负责起草单位：中海油大津化工研究设计院、天津正达科技有限责任公司。本部分主要起草人：白莹、张全、邵宏谦。本部分于1993年首次发布。
1范围
工业循环冷却水中菌藻的测定方法GB/T 14643.4—2009
第4部分：土壤真菌的测定平血计数法GB/T14643的本部分规定了工业循环冷却水中土壤真菌的测定方法。本部分适用于工业循环冷却水中十壤真菌的测定，也适用于源水、生活用水及其他水中土壤真菌的测定。
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过GB/T14643的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。
GB/T603化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备（GB/T603—2002，ISO6353-1：1982，NEQ)
GI3/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682--2008.ISO3696：1987,MO1))3方法提要
本部分采用十壤真菌培养基,用平而计数技术，在(2911)C培养72 h.测定工业循环冷却水中上真菌的总数。
试剂和材料
本部分所用试剂，除非另有规定，应使用分析继试剂和符合GB/T6682中三级水的规定。试验中所需制剂及制品，在没有注明其他要求时，均按GB/T603之规定制备4.1马铃薯：市售新鲜(无芽）,去皮后切成约20mm×20 mm×20 mm小块。4.2葡萄糖。
4.3琼脂：生物试剂。
4.4氯化钠。
4.5乳酸。
艺醇液：75%（体积分数）。
硫代硫酸钠。
4.8牛皮纸。
4.9医用脱脂梯。
医用脱脂纱布。
5仪器、设备
5.1无菊箱（室)或超净工作台。5.2蒸汽压力灭菌。
5.3生化培养箱。
GB/T 14643.4---2009
5.4鼓风电热「燥箱：温度可控制在60℃～280℃。5.5铝锅：200tmm。
5,6摘瓷量杯:1 000 ml.。
5.7 磨口三角瓶:1 000 mL。
5.8 培养Ⅲ:90 mml。
5.9磨口试剂瓶：1000mL
5.10刻度吸管：1 ml
5. 11 刻度吸管:5 ml.c
5.12三角瓶：500 ml-。
6试验前的准备
6. 1培养基的制备
称取约200g的马铃薯丁铝锅中，划水药1000mI在电炉上加热溶解后，趋热用四层医用脱跆纱布过滤到塘瓷量杯中,收集到约 900 mL滤液,滤液搅匀待用。于上述滤液中加人20.0 琼脂和20.0 g衡萄精，并放在电炉上加热，不断地揽拌，待琼脂完全溶化后趁热用四层医用脱脂纱布过滤于捕瓷量杯中,用热水补充至 1000mL,并用乳酸调节 pH至 4.0士0.1,并分装在500mL三角瓶中,每瓶分装量不超过其总量的2/3，塞上棉塞，再用牛皮纸把瓶口包好，用蒸汽压力灭菌器丁（121士1）℃灭菌15min6.2无菌稀释水的制备
6.2.1生理盐水的配制：称取8.3g氯化钠溶解在1000mL水中，漏匀。6.2.2将牛理盐水分装在100mL磨口三角瓶中，每瓶45mL，每个三角瓶塞子和瓶口间插入小纸片·紧瓶塞，舞个瓶子的瓶口均用牛皮纸包扎以防污染，用蒸汽压力灭菌器于（121土1)℃灭菌15 min.
6.3刻度吸管的灭菌
6.3.1将洗净并烘干后的吸管粗端塞上医用脱脂棉，棉花量要适宜，长度人约10mm～15mm，棉花不宜露在可外，多余的棉花可以用火焰烧掉。6.3.2每支刻度吸管用一条约40mm~-50mm宽的牛皮纸条，以45左右角度螺旋形卷起来，吸管的尖端在头部，粗端用多余的纸条折叠打结，不使散开，标！量度，若干支挪成一束，置电热十燥箱中于（160二2）℃灭菊2h。
6.4培养皿的灭菌
将洗净并烘干后的培养血10个左右叠在一起，用牛皮纸卷成一筒，置电热下燥箱中于（160土2)℃灭菌2h。
6.5采样瓶的灭菌
将洗净并烘干后的1000mL磨口试剂瓶瓶口和瓶颈用牛皮纸裹好，扎紧，置电热干燥箱中于(1602)℃灭菌2h。
6.6硫代硫酸钠的灭菌
将硫代硫酸钠放人无菌箱（室）内，并均勾地摊在离紫外线灯30cm处，火菌30min。7测定步骤
7.1水样的采集
7.1.1用无菌采样瓶采集被测样品，在采样过程中要保护瓶口和瓶颈，防止这些部分受杂菌污染，瓶内要留下足够的空间，以备测定前摇动。7.1.2若采架的水有余氯，应在采样前，在无菌操作下于无菌采样瓶中加人灭过菌的硫代硫酸钠，加人量为每川水样约0.1
GB/T 14643.4—2009
7.1.3水样来集后应立即进行测定，如果2h内不能进行测定，应把水样放在冰箱中，于4℃～10℃保存，保存时间不宜超过24h。经冷冻保存后的水样需测定时，从冰箱中取出，于30℃左右活化4h~5 h再进行测定。
7.2无菌箱（室）灭菌
把实验所用的无菌稀释水、无菌培养Ⅲ、无菊吸管等用品放人无菌箱（室）内，打开紫外线灯灭菌30min。
7.3水样的稀释和接种
7.3.1关掉紫外线灯，打开荧光灯，将待测水样放入无菌箱（室）中，立即用75%的乙醇溶液浸泡的医用脱脂棉擦手，点燃无菌箱(空)内的酒精灯。以下对水样的稀释和接种的操作应在无菌销（窄)内的火焰区进行。7.3.2选择适宜的稀释度，应使最后一个稀释度接种后培养血中生长的菌落数小于300个，在空白稀释水样瓶上标上稀释倍数。
7.3.3用10倍稀释法稀释水样，即用5mL无菌吸管吸吸5mL水样注人到45mL空白稀释水中充分摇勾，此时稀释度为10。
7.3.4另取一支5mL无菌吸管吸取5mL10-水样注入到第二个稀释水中，充分播勾，此时稀释度为102，依次类推，直至需要的稀释度为止。7.3.5将不同稀释度的水样分别接种到无菌培养阻中，每个稀释度重复接种3-5个血，每血接种1mI.,接种时左于掌托住培养Ⅲ，人拇指和食指轻轻将培养血提起，吸管与培养Ⅲ底成45°角相接。移开吸臂时，吸臂不宜再碰到培养血，接种时间不宜超过4 S。每接种一个稀释度更换·支无菌吸管。7.3.6另坡一组培着血不接水样，作为空白。同时操推。7.3.7将灭过菌的培养基冷却至（45七1)℃，按7.3.5的方法掀开培养而盖，将培养基灌人培养血内，每肌应灌15IuL～20umL。灌时不要使培养基直接灌在水样1,灌匪后要将融化的培养基和Ⅲ中水样彻底混合，小心勿使混合液溅到培养Ⅲ的边缘。测定一个水样从接种到灌瓜不得超过20min。7.4培养
待培养血中培养基固化后，倒置平，在生化培养箱中（29土1)℃培养72h。8计数与报告
8.1培养之后,取出培养血,荠空白培养血内出现菊游,表明测定过程中有污染，本次测定无效。8.2选择平均菌落数在30～300之间的稀释度，立即进行计数，求得平均菌落数，并修约成二位有效数字(见表1示例 1)。
8.3若有两个稀释度，其生长菌落数均在30～300之间，则视二名之比值来决定，若其比值小于2，应报告其平均数，若人于2则报告其中较小的数字（见表1示例2及示例3）。8.4著所有稀释度的平均菌落数均大于300,则应选择稀释度最高的培养血计数（见表1示例4)。8.5若所有稀释度的平均菌落数均小于30,则应选择稀释度最低的培养血计数（现表1示例5）。8.6若所有稀释度均无菌落生长，则以“小于1乘以最低稀释倍数报告之（见表1尔例6)。8.7著所有稀释度的平均菌落数均不在30～300之间，其中一部分大于300而另部分小于30时，则选择最接近30或300的培养血计数（现表1示例7），8.8土壤真菌的总数以μ表示，单位为个每毫升（个/tmL),按式(1)计算：x
武中：
X,-一计数得出的培养Ⅲ上长出的平均菌落数，个F-计数组的样品稀释倍数。
GB/T14643.4—2009
9精密度
稀释度及菌落数
两稀释度
蘭落数之比
十壤真菌总数
个/mL
313000
30 600
报告方式
个/mL
2. 7×10*
9.1由于微生物能以单独个体、双双成对、链状、成簇或一闭闭等形式存在，而且没有单独--种培养基能满足一个水样中所有细菌的生理要求。所以，由此法所得的菌落数叫能要低于其正常存在的活细胞的数目。
9.2标纽计数的正确度随着平行样血的增加而增加，当使用5个平行血，每血加1nL样品时测定结果的置信度为9%。
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