GB/T 24310-2009 烟草及烟草制品 转基因检测方法 GB/T24310-2009 标准下载解压密码：www.bzxz.net

ICS65.160
中华人民共和国国家标准
GB/T24310—2009
烟草及烟草制品
转基因检测方法
Tobacco and tobacco products-Detecting method of genetically modified organism contents2009-09-30发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2009-12-01实施
GB/T24310—2009
规范性引用文件
术语和定义
实验室要求
仪器设备
烟叶样品DNA提取方法
转基因烟草定性检测方法
转基因烟草定量检测·
转基因烟草检测验证标准·
检测报告：
附录A（规范性附录）
附录B（规范性附录）
附录C（规范性附录）
附录D（规范性附录）
附录E（规范性附录）
附录F（规范性附录）bzxz.net
附录G（资料性附录）
含EB电泳液的处理方法
各类样品的DNA提取方法
DNA提取物的浓度和纯度的测定方法烟草转基因检测PCR扩增体系与扩增条件溶液的配制
荧光定量PCR扩增体系与扩增条件烟草转基因检测结果报告单
GB/T24310—2009
本标准的附录A、附录B、附录C、附录D、附录E、附录F为规范性附录，附录G为资料性附录本标准由国家烟草专卖局提出。本标准由全国烟草标准化技术委员会（SAC/TC144)归口本标准起草单位：中国烟草进出口烟叶检测站、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局本标准主要起草人：郭兆奎、陈枝南、冯茜、万秀清、颜培强、李丽杰、乔婵、孙宏宇1范围
烟草及烟草制品转基因检测方法GB/T 24310—2009
本标准规定了烟草种子、鲜烟叶、初烤烟、片烟和卷烟烟丝进行转基因成分检测的样品取样方法和实验室检测方法。
本标准适用于烟草及烟草制品转基因成分检测。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T5606.1卷烟第1部分：抽样
GB/T19616烟草成批原料取样的一般原则3术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。3.1
转基因烟草
genetically modified tobacco通过基因工程技术或现代生物技术改变基因组构成的烟草。3.2
increment
在一个取样单位一次取出的一定数量的烟草，构成单样的一部分。［GB/T19616—2004,定义2.6]
样品sample
从一个群体中选取的一个或多个具有代表性的样本单位。3.4
实验室样品
laboratorysample
用于实验室检验或测试的样品，其代表总样。［GB/T19616—2004，定义2.10
检测样品testsample
实验室样品经过研磨和匀浆（如果需要）处理后进行分析测定的样品。3.6
聚合酶链式反应扩增polymerasechainreactionamplificationPCR扩增
模板DNA序列在含有4种脱氧核糖核酸（dNTPs）、引物、DNA聚合酶等的反应体系中，在仪器中通过多次的高温变性、退火和延伸的循环过程，最终使目标DNA片段以几何倍数扩增。1
GB/T24310—2009
巢式PCRnestedPCR
PCR扩增过程中，首先用一对外引物进行第一轮PCR，然后以第一轮PCR扩增产物为模板，使用第一对引物扩增的DNA序列内部的一对引物再次扩增。3.8
半巢式PCRsemi-nestedPCR
PCR扩增过程中，首先用一对外引物进行第一轮PCR扩增，然后以第一轮PCR扩增产物DNA做为模板，使用该模板DNA序列内部的一个引物及第一轮扩增中的一条外引物进行第二次PCR扩增3.9
实时定量PCR扩增real-timePCRamplification在PCR反应体系中加人荧光探针或荧光染料，利用荧光信号积累实时检测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。3.10
看家基因housekeepinggene
细胞或生物体整个生命过程中都持续需要而且必不可少的组成型表达基因。3.11
positivecontrolsample
阳性对照样品
经鉴定为含有检测目标成分的对照烟草样品。3.12
阴性对照样品
anegativecontrolsample
经鉴定为不含有检测目标成分的对照烟草样品。3.13
reagentcontrol sample
试剂对照样品
检测过程中与样品一起进行各种检测操作的试剂参照样品。3.14
提取空白对照样品extractionblankcontrolsample样品DNA提取过程中放置在操作区内的开盖的空白参照样品。3.15
特异性specificity
特异地检测某种物质，并可将其与相似物质、杂质或降解物分辨开来的能力。4实验室要求
4.1样品重复检测
每个待测样品随机分成两份，每份单独进行DNA提取和PCR分析。4.2对照样品
每次试验中均设置阳性对照、阴性对照、试剂对照及提取空白对照。在定性检测时选用0.1%阳性作为阳性对照；定量检测时设置0.1%、0.5%、1.0%、2.0%、5.0%阳性对照建立标准曲线。4.3防止污染
样品准备、样品前处理、DNA提取、PCR反应液加样、PCR扩增和电泳与凝胶观察等操作在相互隔离并具有100%外排风的不同操作间中进行，并设置紫外灯，操作前后进行空间过夜照射。样品研磨在强力通风橱中进行，每个样品更换一次塑料手套；样品的称量应设专用天平，不可在称量试剂的天平室内进行；用于提取DNA和PCR扩增的耗材、用具使用前都应进行灭菌处理，tip头和各种离心管一次性使用。
4.4安全防护
GB/T 24310—2009
整个试验操作过程中必须穿着工作服和佩戴手套，特别在接触EB时应带抗化学腐蚀的手套及口罩。
4.5有毒废弃物处理
4.5.1含EB的电泳液
处理方法见附录A。
4.5.2含EB的凝胶
含有EB的废凝胶暂存于广口瓶中，定期放人生物危害焚烧炉中进行焚烧处理。5试剂
除非特别说明，检测中仅使用分析纯化学试剂和超纯去离子水，PCR反应体系用水应使用电阻率为18.2MQ·cm以上的超纯水。各种缓冲液均冷藏于4℃冰箱，各种酶和抗生素母液冻存于一20℃以下冰箱。
5.1十二烷基硫酸钠（SDS)。
5.2乙二胺四乙酸钠（EDTA）。
5.3十六烷基-二甲基-乙基-溴化铵（CTAB）。5.4Tris碱。
Tris-HCl。
聚乙烯吡咯烷酮（PVP）。
液氮。
三氯甲烷。
异戊醇。
2-巯基乙醇。
乙醇。
硼酸。
氢氧化钠。
琼脂糖。
溴酚蓝。
二甲苯青FF。
溴乙锭。
冰醋酸。
溴乙锭(EB)。
NaCl。
MgCl2。
DNA聚合酶。
10×PCR缓冲液。
尿嘧啶DNA糖基酶（UNG酶）。
dNTPs液(dATP、dCTP、dGTP各2.5mmol/L,dUTP5mmol/L)。DNA标准分子量。
限制性内切酶（Xmnl、EcoRV、Nsil）。SYBR GreenI染料。
5仪器设备
1PCR仪（控温精度士0.3℃）。
GB/T 24310—2009
6.2紫外分光光度计（波长精度0.3nm）。6.3荧光定量PCR仪（控温精度土0.4℃）。6.4电泳系统（50V~600V,10mA~400mA）。6.5紫外分析仪（检测灵敏度：Protein≥0.02ngDNA≥0.05ng）。6.6恒温水浴锅（精度土0.1℃）。6.7高速冷冻离心机（最大离心力30000g）。6.8
微量离心机（最大离心力20000g）。6.9pH计（精度±0.02pH或土2mA)。6.10分析天平（感量0.0001g）。6.11
超低温冰箱（40℃～-86℃）。
微量移液器（10μL、20μL、50μL、100μL、200μL、1000uL，精度≤0.8%～1.0%）。超纯水器（电阻率18.2MQ·cm）。6.14
磁力搅拌器（转速0～2000r/min）。超净工作台［截流效率：99.9999%，层流风速：0.45m/s（90fpm）]。6.15
恒温干燥箱（30℃～300℃，温度波动士1%，控温精度土1%）。7取样
7.1种子
以品种和种子产地为取样单位，即每个品种作为一个样品，对虽为同一品种，但供种单位（种子产地来源）不同，也作为单一样品取样，每一样品随机多点取样10g，样品编号注明品种名称、种子产地7.2鲜烟叶
鲜烟叶样品在田间取样，以品种和种子产地为取样单位随机取样，每个样品在10个不同地块各取一个嫩芽或叶片，编号注明品种名称、种子来源、取样地点、取样单位、取样人、日期等信息，自然失水2d后放人塑料袋中。
7.3初烤烟
以检验批为单位，每检验批的产地和等级应是相同的，50件以下随机选2件各取1个小样，51件～100件取4个小样，101件～150件取5个小样，151件～200件取6个小样，200件以上每增50件（不足50件按50件计）增取1个小样，各小样混合后用四分法缩分出均匀样品2份（每份250g）作实验室样品供检验和复检，实验室样品应密封并填写标签，注明产地、等级报验号、送样单位、取样人。7.4片烟
对于已装箱的片烟，以箱（内装100kg烟叶）为取样单位，用长筒状取样器，每箱随机取约2g烟叶，将每个集装箱的99箱烟叶所取的近200g烟叶作为一个检测样品；也可在复烤加工车间，结合水分测定取样，注明烟叶产地、等级和箱号、取样地点、送样单位和取样人。7.5卷烟
按照GB/T5606.1中规定的方法进行卷烟抽样。8烟叶样品DNA提取方法
8.1样品前处理
8.1.1种子
随机取烟草种子样品放入装有滤纸保湿的培养血中，28℃光照下培养7d，用滤纸吸出表面水分，称种子萌发幼苗质量约900mg，在灭菌的研钵内加液氮研磨呈粉末，分别装人3个已知质量的15mL离心管中，再称量，置一20℃冰箱中储存备用。4
8.1.2鲜烟叶
GB/T24310—2009
随机取鲜叶样品约900mg，在研钵内加液氮（5.7）研磨成粉末，转入称量的3个1.5mL离心管中，称量确定叶片组织质量。
8.1.3烤后烟叶
随机取烟叶样品约20g，用硫酸纸包好，置方盘加盖后，40℃恒温干燥箱（6.16）中过夜使其干燥，在灭菌的研钵中研成粉末，存于20mL离心管中，从中取约60mg分别放入两个1.5mL离心管中。8.1.4卷烟
随机取卷烟50支，去除卷烟纸、滤嘴，将烟丝按8.1.3方法前处理。8.2DNA提取
方法见附录B。
8.3DNA产量和纯度测定
方法见附录C。
9转基因烟草定性检测方法
首先进行共有序列标志的PCR扩增，再通过巢式PCR、限制性内切酶酶切和目的基因序列扩增方法进行验证，确定所转目的基因的种类。9.1共有序列标志的PCR扩增
9.1.1 PCR 引物
用于转基因烟草检测共有标志主要有：花椰菜花叶病毒35S启动子、根癌农杆菌nos终止子和编码卡那霉素抗性基因（NPTII），根据这些核甘酸序列设计PCR引物进行烟草转基因检测。9.1.1.135S启动子序列扩增
35S-1:5'CTACAAATGCCATCATTGCG335S-2:5GGGTCTTGCGAAGGATAGTG 3该引物的扩增片段长度为205bp，作为转基因烟草检测的标志，确定花椰菜花叶病毒35S启动子序列的存在。
9.1.1.2nos终止子序列扩增
NOS-1:5'GATTGAATCCTGTTGCCGGT -3NOS-2:5*GTAACATAGATGACACCGCG-3该引物的扩增片段长度为213bp，作为转基因烟草检测的标志，确定来自根癌农杆菌的终止子序列nos的存在。
9.1.1.3NPTII基因序列扩增
NPT-1:5GCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGC-3*NPT-2 :5'GCAGGCATCGCCATGGGTCACGACGA-3*该引物的扩增片段长度为411bp，作为转基因烟草检测的标志，确定卡那霉素抗性基因NPTII序列的存在。
9.1.2PCR扩增体系
见附录D。
9.1.3PCR扩增条件
见附录D。
9.1.4电泳及凝胶观察
称琼脂糖（5.14)溶于0.5倍TBE缓冲液（第E.10章）中，制成1.5%凝胶，加EB（0.5ug/mL），待温度降至55℃左右时倒人放有梳子的凝胶模具中，冷凝后拔出梳子，放人水平电泳槽中，取10L扩增产物加漠酚蓝上样缓冲液（第E.11章）点样，加DNA标准分子量标记（5.26）电泳（6.4），紫外分析仪(6.5)观察电泳结果。
GB/T24310—2009
特异性基因序列的PCR检测
在烟草上进行过转基因研究的主要有烟草普通花叶病外壳蛋白基因（TMV-cp）、黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因（CMV-cp）、马铃薯Y病毒外壳蛋白基因（PVY-cp）、TMV和PVY病毒复制酶基因和苏云金杆菌杀虫蛋白（BT)等基因，根据这些目的基因序列，设计引物用于阳性样品的目的基因鉴定。9.2.1烟草普通花叶病外壳蛋白基因TMV-cpTMV1 5'-GTGTTCTTGTCATCAGCGTGGGC-3’TMV2 5′-CACCGTTGCGTCATCTACTCTACG-3*其PCR扩增产物片段长度为327bp。9.2.2黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因CMV-cpCMV1 5′-ACCCAACCTTTGTAGGGAGTGAGCG -3”CMV25'-ACATAGCAGAGATGGCGGCAACG-3\其PCR扩增产物片段长度为264bp。9.2.3马铃薯Y病毒外壳蛋白基因PVY-cpPVY15'-GATATTTCAAATACTCGGGCA-3PVY25-GCATAACGCGCTAAACCCAT-3*其PCR扩增产物片段长度为362bp。9.2.4TMV复制酶基因TMV54KD
T54D1 5\- GAGTTGTCTGGCATCATTGA -3\T54D2 5'-ACAATGGTCAAAGCCGGGTA-3\其PCR扩增产物片段长度为296bp。5PVY复制酶基因PVY-nib
PVY nib1 5-GCTCCGGTGTAAGGAGAAGA -3*PVYnib25'-GtGAGCCATCAGCATCACAG-3”其PCR扩增产物片段长度为230bp。9.2.6苏云金杆菌杀虫蛋白基因Bt-cryIA（c）BT1 5′-CAGTTTCTGCTCAGCGAGT -3\BT2 5'-GCTGAGGTGAAGATTAGCTG-3”其PCR扩增产物片段长度为381bp。9.2.7黄瓜花叶病毒微卫星RNACMVsatRNACMVsat15'-CTGCGTGATGATCCTTCACT-3\CMVsat25'-TTCACGGAGATCAGCATAGC-3其PCR扩增产物片段长度为322bp。9.2.8豇豆胰蛋白酶抑制剂基因CpTIcptil 5'-TTGCTTGAACCACCTCGGAACT -3\cpti2 5'-CTTGCCTGGCATTGATCGTGTA-3\其PCR扩增产物片段长度为196bp。9.2.9草甘麟耐药基因EPSP（5-烯醇丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶）EPSP1 5'-tccagccatccgcgaacaag -3'EPSP2 5'-agcagcggcggaatcagcat -3'其PCR扩增产物片段长度为265bp。上述各种引物(9.2.1~9.2.9)PCR扩增体系和条件见附录D。9.3结果验证试验
对于35S启动子和nos终止子序列引物的PCR扩增均未出现阳性条带的样品，进行巢式或半巢式6
GB/T24310—2009
PCR扩增，以提高检测的灵敏度，若仍没有扩增产物，可确定该样品为阴性，不含转基因烟草成分；对于35S启动子和（或）nos终止子序列引物的PCR扩增同时或有一种出现阳性条带的样品，重新提取DNA,重复前述PCR检测排除污染，同时进行巢式PCR扩增和限制性内切酶酶切反应排除非特异性扩增的可能。
9.3.1巢式或半巢式PCR反应验证将第一次扩增的产物（引物为35S-1和35S-2或NOS-1和NOS-2)加超纯水稀释100倍，取1μL作为第二次扩增的DNA模板，以下列引物进行第二次扩增，扩增体系与扩增条件见附录D9.3.1.135S巢式PCR
35S3 5′GATTGTGCGTCATCCCTT-3”35S45'ACAGTGGTCCCAAAGATGGA-3\扩增产物片段长度为127bp。
9.3.1.235S半巢式PCR
35Ssn1 5'-CTACAAATGCCATCATTGCG-3\35Ssn25-GATAGTTGGGATTGTGCGTCA-3*扩增产物片段长度为192bp。
9.3.1.3nos终止子巢式PCR
NOSn15-GAATCCTGTTGCCGGTCTTG-3*NOSn25'-CCCATCTCATAAATAACGTC-3扩增片段长度为104bp。
9.3.2限制性内切酶酶切反应验证应用该验证方法前提条件：PCR扩增过程中，将PCR扩增体系中的dNTPs液中的“dUTP”替换成“dTTP”,浓度为2.5mmol/L。
9.3.2.1PCR产物的纯化
PCR扩增产物凝胶电泳后，紫外观察，并选择特异性条带用锋利刀片切下，应用凝胶中DNA回收试剂盒回收特异性PCR扩增条带（DNA）。9.3.2.2酶切反应
9.3.2.2.135S启动子
对于出现35SPCR扩增条带的回收样品，采用限制性内切酶EcoRV对扩增产物进行酶切分析，方法是先将PCR扩增产物纯化，加限制性内切酶EcoRV5U，35SPCR扩增产物1OL，限制酶2倍体积的酶切缓冲液配制酶切反应液，37℃恒温水浴中酶切3h后，以酶切前后的DNA进行1.6%琼脂糖电泳，紫外分析仪观察胶片上的条带，若为35S特异PCR扩增产物，其205bp片段被酶切成152bp和53bp两个片段。
9.3.2.2.2nos终止子
对于nos引物PCR反应呈阳性的回收样品，利用限制性内切酶NsiI可将213bp的片段切成126bp和87bp的两条片段，反应条件同35S启动子扩增产物的酶切反应。9.3.3扩增产物的测序验证
将PCR扩增条带切胶回收测序，排除非特异性扩增9.4转基因检测控制
凡出现PCR特异条带亮度（或荧光信号）等于或高于0.1%参比对照的样品确定为阳性，有扩增条带，且亮度（或荧光信号）弱于0.1%的样品要重新提取DNA，重复上述检测。10转基因烟草定量检测
选择35S启动子或nos终止子进行荧光定量PCR检测（6.3）。GB/T 24310—2009
10.1TaqMan探针荧光定量PCR检测法10.1.1靶序列引物和TaqMan探针35S启动子靶序列引物：35SF：5\-GTCTTGCGAAGGATAGTGGGA-3”35SR:5'-CACGTCTTCAAAGCAAGTGGA-3TaqMan探针:35STMP:5\-TGCGTCATCCCTTACGTCAGTGGAGAT-3\nos终止子靶序列引物：nosF：5\-AGGATTCAATCTTAAGAAAC-3”nosR:5′-GGATCTCATGCTGGAGTTCT -3’TaqMan探针:nosTMP:5'-ATGTTTGAACGATCGG-3上述靶序列TaqMan探针的荧光标记为5\FAM&3\TAMRA10.1.2看家基因引物和TaqMan探针引物:NR F5-TGTCATGAACAGATGGCTCTAACTCT-3NR R 5′-TACCTTGATTACTCGTCGAGTGAAGA-3′TaqMan 探针:NRSTMP 5'-ATTCCCTTTTTTAATCATTTGAAGGTACTCATTTTTTTCG-3’荧光标记为5'TET&.3'TAMRA
10.1.3反应体系
见附录F。
10.1.4反应条件
见附录F。
10.2SYBRGreenI荧光染料实时定量PCR检测法10.2.1靶序列引物
同10.1.1中35S启动子、nos终止子和nos终止子与NPTII交界处靶序列引物10.2.2反应体系
见附录F。
10.2.3反应程序
见附录F。
10.3标准曲线的建立
10.3.1相对含量标准曲线的建立利用5种已知含量的标准物（含转基因烟草5%、2%、1%、0.5%和0.1%）进行荧光定量PCR反应，建立转基因成分相对含量与PCR反应Ct值（有看家基因同时扩增时应用看家基因与目标基因的△Ct值)之间的标准曲线和回归方程。10.3.2绝对含量标准曲线的建立通过标准物的碱基数和紫外分光光度计（6.2)OD260确定标准物的拷贝数，设置不同拷贝数的标准模板进行荧光定量PCR反应，建立靶序列拷贝数与Ct值（或△Ct值）之间的标准曲线10.4样品阳性含量的分析
各样品的阳性含量根据该样品的Ct值（或△Ct值）和标准样品所建立的标准曲线和回归方程进行计算。
11转基因烟草检测验证标准
11.1DNA提取物的浓度与纯度
DNA提取物浓度≥100ng/μL；
DNA提取物纯度：1.7≤OD260/OD280≤1.9。8
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