GB/T 24404-2009 化妆品中需氧嗜温性细菌的检测和计数法 GB/T24404-2009 标准下载解压密码：www.bzxz.net

1Cs 71. 100.70
中华人民共和国国家标准
GB/T24404--2009/IS0 21149.2006化妆品中需氧嗜温性细菌的检测和计数法Enurmeration and detection of aerobic mesophilic bacteria in cosmetics(IS0 2l149:2006,Cosmctics-: Microbiology--Enumeration anddctcction ofaerobicmesophilic bacteria,IDT)2009-09-30发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总后小国国家标准化管理委员会
2009-12-01实施
GB/T 24404—2009/1SO 21149:2006本标准等采用IS021149：2006化妆品微牛物学需氧嗜温性细菌的检测和计数》（英文版）。本标准等尚翻译ISO21149；2006。为便丁使用,本标准做了下列编辑性修改：a）删除国际标准的前言：
本标推的附录 A、附录 B、附录 C.附录 1) 均为资料性附录。本标推由国家认证认可督管理委员会提出本标准由全国进出口食品安金检测标准化技术委员会（SACTC445）归口本标准起草单位：中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中华人民其和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国河南出人境检验检疫局。本标准主要起草人：顾鸣、韩伟、苗丽，赵宏、杨捷琳、靳游彤1
http://foodmate.ne1范围
GB/T 24404—2009/ISO21149:2006化妆品中需氧嗜温性细菌的检测和计数法本标准规定了化妆品中需氧嗜温性细菌的常规检测和让数方法，可经需氧培养后对琼脂培养湛上的菌落数计数，或检查经增菌后有无细菌生长。本标准可能不适用丁某些难溶丁水的产品和清洁类用品等样品的检验，可用被证实具有相同效果其他试验方法替代。必要时，可选用本标准的参考文献中列举的确证方法对检测和计数的微生物进行确证。
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款，凡是注且期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡足不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。ISO21148化妆品微生物学微生物检验通则3术语和定
下列术语和定义适用于本标准。3. 1
露氧嗜温性细菌aerohic mesophilic hacteria在本标准规定的需氧条件下生长的嗜温性细菌，注：在该紧件下，酵母菌、霉菌等其他类型的微生物也可能生长，3.2
产品product
实验室获得用于检测的化妆产品部分3.3
样品samplc
检测中用于制备初悬液的产品部分（牟少1g或1mL）3.4
初悬液initial suspension
一定体积的溶液（稀释莉，中和剂，肉汤或其混合韧）制放的样品悬液战藏。3.5
样品稀释液sampledilution
用于制备初悬的稀释液。
4原则
4.1一般性原则
本方法涉及非选择性琼脂培养基上的菌落蒋计数，或是增菌后有无细菌生长。样品中可能抑制细菌生长的物质应被中和，以便于检测存活的细菌。无论何种情况和使用何种方法，对产品抑菌性能的中和效果都应被检查和确认，
GB/T 24404—2009/ISO 21149:20064.2平板计数法
平板计数法包括以下步骤：
使用特定培养基，制备倾注平板或涂布平板，然后将一定量产品的初悬液或稀释液接种到平板中；
将平板在有氧条件下32.5℃±2.5℃培养72h±6h；-计-数菌落形戒单位(CFU),并计算舞mL或每g产品巾带氧嗜温性细菌的数量，4.3膜过滤法
膜过滤法包括以下步骤：
按验证过的步骤（见13.3.4），将一定晟制备好的样品悬液，涵过事先由少量无菌稀释剂润湿的过滤装置进行过滤处理和清洗，然后将过滤膜移至特定琼脂培养基的表询（见IS021148）：在有氧条件下,置 32. 5 ℃±2. 5 ℃培养 72 h±6 h;一一计数菌落形成单位(CFU),并计算每毫升(rmL.)或特克(g)产品中需氧嗜温性细菌的数量4.4经增菌处理后检测细菌
增菌底细荫的检测包括以下步骤：将一定最初息液加入到非选择性液体培养基（含有合适的中和剂和/或溶剂）中，置32.5℃士2.5 ℃条件下,至少培养20 h;
将一定量的上述增菌液接种到非选择性琼脂培养基上，在有氧条件下32.5℃+2.5℃、培养48h~~72h；检查细菌生长情况结果表达为每份质量或体积的样品中需氧嗜温性细菌\阳性/阴性”。5稀释剂、中和剂和培养基
5.1原则
通常的规格要求在IS021148巴有详细描述。配制用水为蒸馏水或纯净水在IS021148中也有详细规定。下列稀释剂,中和剂和培养基适用于需氧嗜温性细菌的检测,其他证实有效的稀释剂、中利剂和培养基也可用乎术标准。
5.2中和稀释剂和稀释剂
5.2.1原则
稀释剂用于分散样品，如果样品含有抑菌性物质，稀释剂中可添加中和剂，在检测前应该确认中利剂的效果（见第13章）；有关合适的中和剂信息在附录A有介绍。5.2.2中和稀释剂
5.2.2.1酪蛋白消化物-大豆磷脂-吐温20培养基(SCDLP20肉荡）5.2.2.1.1成分
胰酶消化的酪蛋白
大丽卵磷脂
吐温20
5, 2. 2. 1. 2 制备
将叶温20溶于96mL水中，乍49℃十2水浴中加热混勾；然后加人嗨消化的酪蛋白和人豆卵磷脂，持续加热30min溶解：混个均匀后分装至合适的容器中.置121亡高压灭菌1!min后，在室温下调整 PH值至7. 3--0.2。
5.2.2.2其他中和稀释剂
适当情况下也会用到其他中和1剂,参见附录 A和附录 B。2

5.2.3稀释剂
5.2.3.1液体A
5.2. 3. 1. 1成分
动物性蛋白蕨
5.2.3.1.2制备
CB/T 24404--2009/IS021149:2006将1宫蛋白陈溶1.0L水中，加热并持续搅拌溶解：混金均勾后分装至金适容器中，置121℃高压灭菌 l5i min。灭菌后,牵温下调整 pH值为 7.I士U. 2。5.2.3.2其他稀释剂
适当情况下也会用到其他稀释剂，参见附录。5.3细菌悬液稀释剂（胰蛋白陈盐溶液）5.3.1成分
胰蛋白陈
氯化钠
5.3.2制备
I 000 ml.
将上述成分溶解在水，加热并持续搅拌，混合均勾后分装至合适穿器中，置121℃高压灭菌15 min 后，在室温下调整 pH值至 7. 0 ±: 0. 2.5.4培养基
5.4.1原则
培养基应按如下方法配制，或按照制造商所介绍的方法使用脱水培养基。当合成培养基的成分和（或）使用范围与这里给出的配方相向时也可使用，5.4.2计数用培养基
5.4.2.1大豆酪蛋白消化物琼脂培养基(SCDA)或胰陈大豆琼脂斜面(TSA)5.4.2.1.1成分
胰酶消化的酪蛋白
大豆粉木瓜蛋白酶消化物
氯化钠
5.4.2.1.2制备
j 000 ml.
将上述成分或完全脱水培养基溶解在水中，加热搅拌溶解；然后分装在合适的容器中，置121℃高压灭菌15 min后，在室温卜调整pH值至7.3士0.2。5.4.2.2其他计数用培养基
适当情况下也会用到其他培养基，参见附录D。5.4.3检测用培养基
5.4.3.1原则
在进行选择时，增菌肉汤和琼脂培养基可用丁细菌检测。增菌肉汤用丁分散样品并增加初始微生物的数量。若待测样品見行抑菌性时·在增菌肉汤可添加中和剂，5. 4. 3. 2增菌肉汤:Eugon Lr 100 肉汤5.4.3.2.1 原则
这种培养基包含H有4和样品中抑制性物质的成分（卵磷脂和吐温80)和分散剂（辛基酚聚醚9），3
GB/T24404-—2009/1S021149:20065.4.3.2.2成分
胰酶消化的酪蛋白
大豆粉本瓜蛋白酶消化物
L-胱氨酸
氯化钠
亚硫酸钠
葡萄糖
卵磷脂
旺游80
辛基龄聚醚9
5.4.3.2.3制备
1000ml
将让湿80、辛基酚聚醚9和卵磷脂先后溶解在沸腾的水中，直至完全溶解；再边加热搅拌边加人其他成分进行溶解；然后将培养基分装在合适的容器中。置121℃商压灭菌15min后，在室温下调整pH值垒 7. 0±0. 2。
5.4.3.3检测用琼脂培养基
5, 4.3.3. 1Eugon 1.T 100 琼脂培养基5. 4.3.3. 1. 1成分
胰酶消化的酪蛋白
大豆粉木瓜蛋白酶消化物
T-胱氨酸
氯化钠
亚硫酸钠
卵磷脂
呢温80
宰基酚聚醛醚S
5. 4. 3. 3. 1.2制备
1 000 tnL.
将叶温80、辛基酚醚9和卵磷胎先后溶解在沸腾的水中，直至完溶解；再边加热搅拌边加人其他成分行溶解，轻轻搅拌避免飞溅：然后将培养基分装在合适的容器中；置121℃高低灭菌15min灭菌后，准窄温下调整pH值至7.0±0.2，5.4.3.3.2其他检测用琼脂培养基其他可使用的培养基可参见附录D。5.4.4标准菌株培养用琼脂培养基使用人H.酪蛋白消化物琼脂培养基（SCDA)或胰陈人豆琼胎斜而（TSA)(5.4.2.1）6仪器设备及玻璃器血
仪器、设备和玻璃器血见IS0)21148合品伙伴网ht
7微生物菌种
GB/T24404—2009/ISO 21149:2006为了验证中和剂的功效,分别使用了革兰氏阴性和阳性2的两种标准菌株：铜绿假单胞菌ATCC9027(等效菌株：CIF82.118NCIMB8626.NBRC13275、KCTC2513或其他等效的国家收藏标雅菌株）：—金黄色葡葡球ATCC\6538（等效菌株：CIP\4.83、NCIMR）9518、NBRC1327G、KCTC21916或其他等效的国家收藏标雅菌株）其他可供选择的革益氏阴性菌株有：大肠杆菌ATCC8739（等效菌株：CIP53.126、NCIMB8545、NB3RC39722、KCTC2571或其他等效的国家收藏标准株），应按照标推菌株供应商提供的操作打法复苏菌种，菌种应按EN12353要求保存在实验室中。8化妆品产品和实验室样品的处理如果待测的化妆品在室温下保藏的话，在分析前后不需要对产品（3,2)和样品（3,3)进行孵育、冷藏和冷冻处理。
待测化妆品的抽样见ISO2[148，样品的分析按照ISO21148的要求和下列步骤进行。9步骤
9.1 -般建议
使用无菌材料、仪器和无菌操作技术来制备样品、初悬液和稀释液。样品初悬液从完成制备划接种培养基内的时叫不能超过45 min,除非程序或文件中有特别注明。9.2初悬液的制备
9. 2. 1原则
在检测中，使用至少1g或1mL的混合均匀的产品来制备样品初悬液。注：S代表样品准确的质量或体积初悬液通常是1：10的样品稀释液。如果存在重度污杂和（或）1：10的稀释液仍存在抑菌性，就需要更大的稀释液或增菌肉汤。9.2.2水溶性产品
依照方法的要求，将化妆品样品（S)加人到适当体积的中和稀释剂（5.2.2）稀释剂（5.2.3)或增菌肉汤(5.4.3.2)中。
注：稀释倍数为d。
9.2.3非水溶性产品
将化妆品样品（S)加入到装有适量促溶剂（例：吐温80)的合适容器中。将样品分散在促溶剂中，按照方法的要求，加人适量（例：9ml)的中和稀释剂（5.2.2）稀释剂(5.2.3)或增菌肉汤（5.4.3.2)中注：稀释倍数为±。
9.3讨数方法
9.3.1稀释计数
通常，初悬液最初始的计数稀释度。依照产品污染的预期程度，如果必要的话，可使用析同的稀释剂将初悬液进行连续稀释，制成系列梯度的稀释液（例：1：10稀释度）。1CIP：法国巴斯德研究所菌种保藏中心2)KCTC:韩国典弹菌种保获中心：3）ATCC:美国标推生物品收减中心。)NCIMB:英润食品工业j海祥细菌菌种保蔽中心。5）NHR:H本技术评价研究所生物资源中心5
CB/T24404—2009/1S0 21149:2006一般计数方法至少需要两个培养。们在常规检测中或间一种样品的梯度稀中或参考以前的结果时，可以只使用一只培养Ⅲ。9,3.2平板计数法
9.3.2.1倾注平板法
在直径为85mm~100)mm的培养血中，加人1rmiL初悬液和样品稀释液（见第13章），倒人5raL~20mL琼脂培养基（5.1.2)（保存在不超过48℃的水浴中），如果使用更大的培养L，倒人的琼脂培养基的量虚相应增加，
小心旋转或倾注平板以使初悬液和（或)样品稀释液与培养基充分混合。在室温下，将培养Ⅲ放置丁水半面上使平皿中的混合物凝固。9.3.2.2涂布平板法
作直径为85mu～100m的培养血中，圳人15mL~-20mL混合好的琼脂培养基5.4.2）（保存在不超过48℃的水浴中）。如果使用较大的培养Ⅲ，琼脂培养基的量应相应增加。将培养Ⅲ放人微生物箱或培养箱中使其冷却凝固。然后，将不少了0.mL的初悬液和（或）确认制备好的样品稀释液（见第 13 章）,涂布在培养基的表而。9.3.2.3膜过滤法
使用表面孔径小于C.45μm的滤膜。将适量的初悬液和样品稀释皴（见第13章）（不少1g或1mL的产品为宜)加到滤膜上，立即过滤和洗膜（按照确认的步骤进行，见第13章）。将滤膜转移至琼脂培养基的表面（5.4.2）。
9.3.2.4培养
除非有其他规定，常倒置平板放人32.5℃士2.5℃的培择箱中，培72h±6h后，立部讨数半板上的菌落数，如果不能立即计数，可将平板保存在冰箱内-但保存时间不得超过24h。注：在某些情况中，产品内存在影响菌落计数的潜在物质时，则可以使用保存于冰箱中的具有相同样品稀释度和班脂培养基的平行平板与培养过的乎板进行比较。9.4增菌
9.4.1原则
使用增菊肉汤（5.4.3.2)制备初悬液（见9.2）时，选择下列步骤进行硫认（见第13章）。9.4.2样品培养
9.4.2.1原则
用肉汤（5.4.3.2)制备的初悬液，置32.5℃士2.5℃下培养至少20h。9.4.2.2次培养
使用灭菌移液管，将0.1mL~0.5ml培养后的初息液移至装有大约15mL~20ml.的适合的选择性培养基（5,1.2.1)的表而（培养血直径85rnm-~100mm）。如果使用较大的培养函，琼脂培养基的量应相应增加。
9.4.2.3培养
翻转培养平板（或者等到加人的悬液被晾脂吸收后再翻转），置32.5℃上2.5℃下培养48h～72 h.
10菌落计数（平板计数和膜过滤法）培养后，计算菌落数：
-培养血中应有30CFU~300CFU如果低于30CFU,见12.2.3。在膜上应有15CFU.~150CFU,如果低于15CFU,见12.2.311生长的检测（增菌法）
增菌液移至琼脂培养板进行培养后，检查琼脂表面，记录有无细荫生长。12结果表示
12.1平板菌落计数的计算方法
计算样品(S)中的细菌数量N,按式(1)、式(2)、式(3)计算：N--m/(VXd)
N =c/(V Xd)
N- x./(VXd)
式中，
平行样菌落计数的算术平均数；V—-每个乎-中接种物的体积，单位为毫升（mL);Q
在合适计数范围内的最低稀释度的稀释倍数；单个平-板上的菌落数；
文两个连续稀释度的菌落计数的加权半均数.X。按式(4)计算：
x,=Ze/(n+0.1m)
c——两个连续稀释度的所有平板的总菌落数；n——在合适计数范闺内的最低稀释度的平板数；在合适计数范围内的第一个稀释度的平板数。nz
GB/T 24404—2009/IS0 21149:2006(1)
-（4）
计算结果保留两位有效数字。如果最后一位数字小于5，则前一位数字无须更改，如果最后…位数字人于5，则前一位数加一位。逐步进行，直至得到两位有效数字，注意得到的数字N。12.2说明
12.2.1应充分考患平板计数法固有的变异性。当两个结果之间的差异超过50%，或者用10g表示超过0.3，即认为这两个续果存在差异。为了计数的精确性，！计数乎上菌落数在30～300之间或滤膜上菌落在15～150之的培养Ⅲ。按照所采用的方法检查不同稀释倍数下的菌落数（则第13章）。12.2.2当半板上菌落数在30~300之间或膜上菌落数在15.~150之间，结果表示如下这里S表示样品（9.2)的质量或体积]：
若S垒少为1g或ml，V至少为1mL,那么每毫升或每克样品中需氧嗜温性细菌的数量-N/S;
若S少于1g或1mL，且/或V低丁1mL，那么样品中需氧嗜温性细菌（注意用于检测的样品的量应计算在S和V之内)的数量=N。将结果表示为1.0至9.9之间的数乘以10的幂指数（见12.3.1、12.3.2、12.3.3和12.3.7)。12.2.3当平板上菌落数低于30或者膜上菌落数低于15，结果表示如下：若S至少为1g或1mL，HV至少为1ml，那么每毫升或每克样品中需氧嗜温性细菌的估算数量-N/S;
-若S少于1g或1mL，H/或V低于1mL，那么样品中需氧嗜温性细菌（注意用于检测的样品的量应计算在S和V之内)的估算数量=N。S表示样品的质量或体积（9.2）将结果表示为1.0至9.9之闻的数字乘以10的辱指数（见12.3.4.12.3.5和12.3.6)。12.2.4当没有观察到有术落生长时，结果表示如下：每毫升或每克样晶中需氧嗜温性细菌的数量低于1/d×V×S(S至少为1g或1mL)；一样品S巾需氧嗜温性细菌的数量低于1/dXV（注意用十检测的样品的量应计算在S和1V之内）(S少于1g或1mI)。
GB/T 24404—2009/ISO 21149:2006d为初悬液（9.2)的稀释倍数V为1(平板技术法利膜过滤法)或0.1（涂布半板法）（见12.3.8）。12.3举例
12.3.1例1一个稀释度两个平板
S=1g或1mL;V=1;计数可得：稀释度为10／.38和42。根据式(1)：
每毫升或每克样品中需氧嗜温性细菌的数量N=m/（V×d）40/(1×10*1）=40/0.1---400或1×10。
12.3.2例？一个稀释度一个平板S=1名或1mL;V-1:计数可得：稀释度为10、60。根据式（2)：
每毫升或每克样品中需氧嗜温性细菌的数量N=c/V×d）=60/(1×10°+）：60/0.1-600或6x10\.
12.3.3例3两个稀释度两个平板
S=1g或1mL;V=1：计数可得：稀释度为10-2、235和282；蒂释度为103,31和39根据式（3）：
每毫升或每克样品中需氧嗜温性细菌的数量NX/（V×d)=(235+282+31--39)/(20.1×2)×1O- 587/0. 022=26 682。
将上述结果进行数字修约，结果为每毫升或每克样品中需氧嗜温性细菌的数量是27000或2.7×10*
12.3.4例4个税释度两个过滤膜
S=1g或1nL;V=1;计数可得：稀释度为10，、18和22。根据式（1）：
每毫升或每克样品巾需氧嗜温性细菌的数量N=m/V×）=20/（1×10）2G/0.1=200或2×10z
12.3.5例5一个稀释度一个过滤膜S=1g或1ml.;V=1;计数得：稀释度为10l,65。根据武（2)：
每毫升或每克样品中篇氧温性细菌的数量N=c/（V×α）~65/（1×10-1）=65/0.1=650或6. 5×102
T2.3.6例6两个稀释度两个过滤膜S-1g或1mL;V=l;计数可得：稀释度为10-1、121和105；稀释度为10*215和25。根据式(3)：
每毫升或每克样品中需氢嗜温性细菌的数量N-X./V×d)=（121+105+15-+25)/(2+01×2)×10-/=266/0.22=1 209.
将上述结果约整为每毫升或每克样品中需氧嗜温性细菌的数量足1200或1.2×[0″。12.3.7例7一个稀释度两个平板
S1#或1mL;V.:1;计数可得：稀释度为0+、28和22。根据试（）：
Nm/(VXd)25/(1×10-1)25/0.1=250。每毫升或每克样品中需氛嗜温性细菌的估算数量为250或2.5×10°。12.3.8例8
S1 或上m1.;V=1;计数可得：稀释度10-1、0和0。8
根据式(1)：
N≤1/(VXd)www.bzxz.net
≤1/(1×10 )
每毫开或每克样品中需氧嗜温性细菌的估算数量低了10，12. 3. 9 例 9
S=1g或1mL;V=1；计数可得：稀释度为10-1、0和3。根据式(1)：
N≤m/(VXd)
1.5/(1X10-)
≤1.5/0.1
每毫升或每克样品中需氧嗜温性细菌的估算数量低于15。12.4增菌后检测
GB/T 24404-2009/ISO 21149:2006具有生长的情说下（见第11章)，结果表示为“样品S中存在需氧嗜温性绷菌”，然后使用其中--种推荐方法（见9.3)进行计数。如果没有检测到生长(见第11章）.结果表示为“样品 S中不存在需氨嗜温性细菌”。
13产品的抑菌性的中和处理
13.1原则
以下不同试骑说明牛物叫认在分析条件长。带用下证期化妆品抑菌性的两种菌探（见翰了章，被确认对抑菌物质真有较广泛的敏感性：13.2接种物的制备
在试验前，每种菌株都应先接种在大立酪蛋白琼胎培养基(SCDA)或其他合适（非选择性、非中和性)培养基土，置32.5℃土2.5℃培养18 h～24 h。为了收集细菌培养物，使用灭菌接种环,刮取培养基表面细菌重新悬浮于稀释液中，以获得细菌悬浮羧（5，3），使用分光光度针调整细菌浓度为1×10°CFU/mL，此细菌悬液及其稀释液需在2h内使用。13.3计数方法的验证
13.3.1原则
将样品液（初悬液或者因为产品的抑菌性过强或溶解性过低制成的样品稀释液）与每个细菌菌株的稀释液混勾、中和后，将中和液移至培养Ⅲ或过滤膜.上，经培养后，与不含有样品的对照组进行菌落特性和菌落数的比较。
如果菌落数乍不延对照组的50%(0.3 10g)以下,则需要谢整内容(稀释剂,中和剂或混合肉汤，参见附录A）。应充分考虑平板计数法固有的变异性。当两个结果之间的差异超过50%,或者用log表示超过0.3，即认为这两个结果存在差异。接种的标准菌不生长说明该检测方法无效，除非认为产品的微生物污染是不同的。
13.3.2倾注平板法的验证
将9ml.初悬液和（或）用中和稀释剂稀释的样品稀释液与1mL含有000CFUJ/mI.3000CFU/mL的微4:物菌悬液混合。移取1mL至培养Ⅲ（最好有平-行样）中，例入15mL~20mL混勾的琼脂培养基（5.4.2)（保存在不超过18℃的水浴中）。平行设立一个使用相同稀释剂和相同微4物9

GB/T24404-2009/ESO21149:2006菌悬液,但不含有样品的对照平板。置32,5℃二2.5℃培养24 h～72 h后，计数平板上菌落数.并比较检测平板与对照平板的菌落数。如果计数结果至少是对照平板的50%(0.31og)以上，可以确认1：10稀释(使用上mI.初悬液)时的稀释液和计数方法是有效的。13.3.3涂布平板法的验证
将9 mL 用中和稀释剂（或其他，见 5. 1)稀释的初悬液与 1 mL 含有10 000 CFU/mL～30000 CFU/mL（使用0.5mL或1ml涂布时可更少)的微生物菌悬液混合，取至少1 ml.涂布在凝固的琼脂培养基表面（5.2)（最好有平行样）。平行制备一个使用相同稀释剂和相同微生物菌悬液但不含有样品的对照-板，置32.5℃+2. 5℃培养24 h-72h后,计数平板上菌落数，并与对照平板F的菌落数进行比较。如果计数结果至少是对照组的50%(0.3log）以上，可以确认1：10稀释（使用1mL初悬液)时的稀释液和让数方法是有效的。T3. 3. 4 膜过滤法的验证
将适量初悬液或检测中使用的样品稀释液（见9.3.2.3)与适量的大约100CFU的微牛物标准悬浮液混合：混合液议即膜过滤，并且使用一定量的水(5.1)、稀释剂（5.2.3)或中和稀释剂(5.2.2)洗涤滤膜，将滤膜转移至合适的琼脂培养基（5.4.2)的表面。平行地制备一个相间条件下不含有样品的对照样品,在相同条件下过滤和清洗，置32.5℃士2.5 ℃下,培养 21 h--72 h后，计数膜上菌落数,并与对照样品的菌落数进行比较。如果计数结果至少是对照军的50%(0.3log）,可以确认膜过滤方法和稀释剂是有效的。
13.4增菌检测方法的验证
13. 4.1步骤
制备含有每种标准菌株愿液、最终浓度为1U0CFU/mL~500CFU/mI.的 5ml细菌悬液稀释液（5.3）；为了计数标雅菌悬液中最终活的细菌浓度，移取1ml.荫悬液至培养中，倾注15ml.20ml琼脂培养基（5.4.2)（保存在不超过48℃的水浴中）。置32.5℃十2.5%条件下，培养20h-~24h.在试管或烧瓶内加入一定量的增菌肉汤（5.4.3.2)，制备与检测时相同条件的样品初悬液双份（至少1g或 1 mL产品),在一个(确认试验)的试管内,无荫接种入0.1 tml.标准菌悉液。混句后,确认试验试管与对照试管均置于32.5℃士2.50条件下，培养20h~24h。便用无菌移液管从每个试管或烧瓶中，移取0.1mL～U.5mL.（与检测条件相同）至含有人约15mL~20ml琼脂培养基培养Ⅲ（直径85mm~100mm)中置32.5℃±2.5℃条作下,培养24h~72h。13.4.2结果的说明
对每个细菌菌株，检查并确认其悬浮液含100CFU/mL-~500CFU/mL的细菌。如果有细菌生长的特征，中和检测方法的验证定义如下：对金黄色葡萄球菌：培养物颜色为黄色；一对铜绿假单胞菌：在确认平板上接种物的颜色为绿色到黄色菌落，在对照平板上不生长。当在对照半板上有细菌牛长（污染产品）时，如果接种的细菌在确认平板上可以恢复生长，可以认为中和捡测方法验证是有效的。
13.5验证结果的解释
验证乎板上细菌不4：长，表明抗菌活性依然存在，并且有必要对方法的条件逊行修改。可通过增证营养肉汤的量、保持相尚的样品数量或者在营养肉汤中添加足量的失活剂，者结合适当的修改来进行完善，以保证纠菌生长。尽管添加适当的失活剂和增加肉汤量，上述可培养微生物还是有可能不能壮，这表明本标准材料提供的信息可能不适合这类微生物。14检测报告
检测报告应列出以下内容：
1）产品完整鉴定所需要的全部信息；10
食品伙伴区
小提示：此标准内容仅展示完整标准里的部分截取内容，若需要完整标准请到上方自行免费下载完整标准文档。