GB 4789.35-2010
基本信息
标准号:
GB 4789.35-2010
中文名称:食品安全国家标准食品微生物学检验 乳酸菌检验
标准类别:国家标准(GB)
标准状态:现行
出版语种:简体中文
下载格式:.rar .pdf
下载大小:233452
相关标签:
食品安全
国家标准
食品
微生物学
检验
乳酸菌
标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
GB 4789.35-2010 食品安全国家标准食品微生物学检验 乳酸菌检验
GB4789.35-2010
标准下载解压密码:www.bzxz.net
标准内容
中华人民共和国国家标准
GB4789.352010
食品安全国家标准
食品微生物学检验乳酸菌检验
National food safetystandardFood microbiological examination: Lactic acid bacteria2010-03-26发布
中华人民共和国卫生部
2010-06-01实施
GB4789.35—2010
本标准代替GB/T4789.35-2008《食品卫生微生物学检验食品中乳酸菌检验》。
本标准与GB/T4789.35-2008相比,主要变化如下:修改了乳酸菌总数、乳杆菌、双歧杆菌和嗜热链球菌的计数方法。本标准的附录A为规范性附录。
本标准所代替标准的历次版本发布情况为:GB4789.35-1996、GB/T4789.35-2003、GB/T4789.35-2008。1范围
食品安全国家标准
食品微生物学检验乳酸菌检验
本标准规定了含乳酸菌食品中乳酸菌(lacticacidbacteria)的检验方法。本标准适用于含活性乳酸菌的食品中乳酸菌的检验。2规范性引用文件
GB4789.35—2010
本标准中引用的文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本标准。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本标准。3术语和定义
3.1乳酸菌lacticacidbacteria
类可发酵糖主要产生大量乳酸的细菌的通称。本标准中乳酸菌主要为乳杆菌属(Lactobacillus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)和链球菌属(Streptococcus)。设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:4.1恒温培养箱:36℃±1℃。
4.2冰箱:2℃~5℃。
4.3均质器及无菌均质袋、均质杯或灭菌乳钵。4.4天平:感量0.1g。
4.5无菌试管:18mm×180mm、15mm×100mm4.6无菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸头。4.7无菌锥形瓶:500mL、250mL。5培养基和试剂
5.1MRS(ManRogosaSharpe)培养基及莫匹罗星锂盐(Li-Mupirocin)改良MRS培养基:见附录A中A.1。
5.2MC培养基(ModifiedChalmers培养基):见附录A中A.2。5.30.5%蔗糖发酵管:见附录A中A.3。5.40.5%纤维二糖发酵管:见附录A中A.3。0.5%麦芽糖发酵管:见附录A中A.3。5.5
0.5%甘露醇发酵管:见附录A中A.3。5.70.5%水杨苷发酵管:见附录A中A.3。5.8
30.5%山梨醇发酵管:见附录A中A.3。5.9
0.5%乳糖发酵管:见附录A中A.3。5.10七叶苷发酵管:见附录A中A.4。5.11革兰氏染色液:见附录A中A.5。2莫匹罗星锂盐(Li-Mupirocin):化学纯。5.12
GB4789.35—2010
检验程序
乳酸菌检验程序见图1。
样品25g(mL)+225mL无菌生理盐水10倍系列稀释
选择2个~3个适宜稀释度,
各以0.1mL加入到MRS平板
进行涂布
厌氧,
36℃±1℃,
48h±2h
乳酸菌总数计数
7操作步骤
7.1样品制备
选择2个~3个适宜稀释度,各以0.1mL加入到莫匹罗星锂盐
(Li-Mupirocin)改良MRS平板进行涂布厌氧,
36℃±1℃,
48h±2h
双歧杆菌计数
GB4789.35—2010
选择2个~3个适宜稀释度,
各以0.1mL加入到MC平板
进行涂布
需氧,
36℃±1℃,
48h±2h
嗜热链球菌计数
挑取双歧杆菌或乳杆菌菌落接种于MRS琼脂平板,嗜热链球菌接种于MC琼脂平板(可选做)菌种鉴定
图1乳酸菌检验程序图
7.1.1样品的全部制备过程均应遵循无菌操作程序。乳杆菌计数
乳酸菌总数减去双歧杆菌
与嗜热链球菌计数之和
7.1.2冷冻样品可先使其在2℃~5℃条件下解冻,时间不超过18h,也可在温度不超过45℃的条件解冻,时间不超过15min。
GB4789.35—2010
7.1.3固体和半固体食品:以无菌操作称取25g样品,置于装有225mL生理盐水的无菌均质杯内,于8000r/min~10000r/min均质1min~2min,制成1:10样品匀液;或置于225mL生理盐水的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1min~2min制成1:10的样品匀液。7.1.4液体样品:液体样品应先将其充分摇匀后以无菌吸管吸取样品25mL放入装有225mL生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中,充分振摇,制成1:10的样品匀液。7.2步骤
7.2.1用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL,沿管壁缓慢注于装有9mL生理盐水的无菌试管中(注意吸管尖端不要触及稀释液),振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀,制成1:100的样品匀液。
7.2.2另取1mL无菌吸管或微量移液器吸头,按上述操作顺序,做10倍递增样品匀液,每递增稀释一次,即换用1次1mL灭菌吸管或吸头。7.2.3乳酸菌计数
7.2.3.1乳酸菌总数
根据待检样品活菌总数的估计,选择2个~3个连续的适宜稀释度,每个稀释度吸取0.1mL样品匀液分别置于2个MRS琼脂平板,使用L形棒进行表面涂布。36℃±1℃,厌氧培养48h+2h后计数平板上的所有菌落数。从样品稀释到平板涂布要求在15min内完成。7.2.3.2双歧杆菌计数
根据对待检样品双歧杆菌含量的估计,选择2个~3个连续的适宜稀释度,每个稀释度吸取0.1mL样品勾液于莫匹罗星锂盐(Li-Mupirocin)改良MRS琼脂平板,使用灭菌L形棒进行表面涂布,每个稀释度作两个平板。36℃±1℃,厌氧培养48h+2h后计数平板上的所有菌落数。从样品稀释到平板涂布要求在15min内完成。
7.2.3.3嗜热链球菌计数
根据待检样品嗜热链球菌活菌数的估计,选择2个~3个连续的适宜稀释度,每个稀释度吸取0.1mL样品匀液分别置于2个MC琼脂平板,使用L形棒进行表面涂布。36℃±1℃,需氧培养48h±2h后计数。嗜热链球菌在MC琼脂平板上的菌落特征为:菌落中等偏小,边缘整齐光滑的红色菌落,直径2mm土1mm,菌落背面为粉红色。从样品稀释到平板涂布要求在15min内完成。7.2.3.4乳杆菌计数
7.2.3.1项乳酸菌总数结果减去7.2.3.2项双歧杆菌与7.2.3.3项嗜热链球菌计数结果之和即得乳杆菌计数。
7.3菌落计数
可用肉眼观察,必要时用放大镜或菌落计数器,记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位(colony-formingunits,CFU)表示。7.3.1选取菌落数在30CFU~300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU的平板记录具体菌落数,大于300CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。
7.3.2其中一个平板有较大片状菌落生长时,则不宜采用,而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数:若片状菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均匀,即可计算半个平板后乘以2,代表一个平板菌落数。
7.3.3当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时,则将每条单链作为一个菌落计数。4
7.4结果的表述
GB4789.35—2010
7.4.1若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内,计算两个平板菌落数的平均值,再将平均值乘以相应稀释倍数,作为每g(mL)中菌落总数结果。7.4.2若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时,按公式(1)计算:N=Ec
/(n+0.1nz)d
式中:
N样品中菌落数:
ZC—平板(含适宜范围菌落数的平板)菌落数之和;ni——第一稀释度(低稀释倍数)平板个数;n2第二稀释度(高稀释倍数)平板个数;d稀释因子(第一稀释度)。
7.4.3若所有稀释度的平板上菌落数均大于300CFU,则对稀释度最高的平板进行计数,其他平板可记录为多不可计,结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。7.4.4若所有稀释度的平板菌落数均小于30CFU,则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
7.4.5若所有稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长,则以小于1乘以最低稀释倍数计算。7.4.6若所有稀释度的平板菌落数均不在30CFU~300CFU之间,其中一部分小于30CFU或大于300CFU时,则以最接近30CFU或300CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。7.5菌落数的报告
7.5.1菌落数小于100CFU时,按“四舍五入”原则修约,以整数报告。7.5.2菌落数大于或等于100CFU时,第3位数字采用“四舍五入”原则修约后,取前2位数字,后面用0代替位数;也可用10的指数形式来表示,按“四舍五入”原则修约后,采用两位有效数字。7.5.3称重取样以CFU/g为单位报告,体积取样以CFU/mL为单位报告。8结果与报告
根据菌落计数结果出具报告,报告单位以CFU/g(mL)表示。9乳酸菌的鉴定(可选做)
9.1纯培养
挑取3个或以上单个菌落,嗜热链球菌接种于MC琼脂平板,乳杆菌属接种于MRS琼脂平板,置36℃±1℃厌氧培养48h。
9.2鉴定
9.2.1双歧杆菌的鉴定按GB/T4789.34的规定操作。9.2.2涂片镜检:乳杆菌属菌体形态多样,呈长杆状、弯曲杆状或短杆状。无芽胞,革兰氏染色阳性。嗜热链球菌菌体呈球形或球杆状,直径为0.5um~2.0um,成对或成链排列,无芽胞,革兰氏染色阳性。9.2.3乳酸菌菌种主要生化反应见表1和表2。5
常见乳杆菌属内种的碳水化合物反应表1
干酪乳杆菌干酪亚种(L.caseisubsp.casei)德氏乳杆菌保加利亚种(L.delbrueckiisubsp.bulgaricus)嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)
罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)
鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)
植物乳杆菌(L.plantarum)
GB4789.35—2010
水杨苷
山梨醇
注:+表示90%以上菌株阳性:一表示90%以上菌株阴性:d表示11%~89%菌株阳性:ND表示未测定。表2
嗜热链球菌(S.thermophilus)菊糖
嗜热链球菌的主要生化反应
注:+表示90%以上菌株阳性:一表示90%以上菌株阴性甘露醇
水杨苷
山梨醇
马尿酸
棉子糖免费标准下载网bzxz
A.1MRS 培养基
蛋白陈
牛肉粉
酵母粉
葡萄糖
吐温80
K,HPO4-7H20
醋酸钠·3H20
柠檬酸三铵
MgSO4-7H,0
MnSO4-4H20
琼脂粉
A.1.2制法
附录A
(规范性附录)
培养基及试剂
GB4789.35—2010
将上述成分加入到1000mL蒸馏水中,加热溶解,调节pH,分装后121℃高压灭菌15min~20minA.1.3莫匹罗星锂盐(Li-Mupirocin)改良MRS培养基A.1.3.1莫匹罗星锂盐(Li-Mupirocin)储备液制备:称取50mg莫匹罗星锂盐(Li-Mupirocin)加入到50mL蒸馏水中,用0.22um微孔滤膜过滤除菌。A.1.3.2制法
将A.1.1成分加入到950mL蒸馏水中,加热溶解,调节pH,分装后于121℃高压灭菌15min~20min。临用时加热熔化琼脂,在水浴中冷至48℃,用带有0.22um微孔滤膜的注射器将莫匹罗星锂盐(Li-Mupirocin)储备液加入到熔化琼脂中,使培养基中莫匹罗星锂盐(Li-Mupirocin)的浓度为50μg/mL。
MC培养基
A.2.1成分
大豆蛋白陈
牛肉粉
酵母粉
葡萄糖
碳酸钙
蒸馏水
1%中性红溶液
1000mL
A.2.2制法
GB4789.35—2010
将前面7种成分加入蒸馏水中,加热溶解,调节pH,加入中性红溶液。分装后121℃高压灭菌15min~20 min。
3乳酸杆菌糖发酵管
A.3.1基础成分
牛肉膏
蛋白陈
酵母浸膏
吐温80
1.6%溴甲酚紫酒精溶液
蒸馏水
A.3.2制法
1000mL
按0.5%加入所需糖类,并分装小试管,121℃高压灭菌15min~20min。A.4七叶苷培养基
A.4.1成分
蛋白陈
磷酸氢二钾
七叶苷
枸橡酸铁
1.6%溴甲酚紫酒精溶液
蒸馏水
A.4.2制法
将上述成分加入蒸馏水中,加热溶解,121℃高压灭菌15min~20min。A.5革兰氏染色液
A.5.1结晶紫染色液
A.5.1.1成分
结晶紫
95%乙醇
1%草酸铵水溶液
A.5.1.2制法
将结晶紫完全溶解于乙醇中,然后与草酸铵溶液混合。A.5.2革兰氏碘液
A.5.2.1成分
碘化钾
蒸馏水
A.5.2.2制法
将碘与碘化钾先进行混合,加入蒸馏水少许,充分振摇,待完全溶解后,再加蒸馏水至300mL。A.5.3沙黄复染液
A.5.3.1成分
95%乙醇
蒸馏水
A.5.3.2制法
将沙黄溶解于乙醇中,然后用蒸馏水稀释。A.5.4染色法
A.5.4.1将涂片在酒精灯火焰上固定,滴加结晶紫染色液,染1min,水洗。A.5.4.2滴加革兰氏碘液,作用1min,水洗GB4789.35—2010
A.5.4.3滴加95%乙醇脱色,约15s~30s,直至染色液被洗掉,不要过分脱色,水洗。A.5.4.4滴加复染液,复染1min。水洗、待干、镜检9
小提示:此标准内容仅展示完整标准里的部分截取内容,若需要完整标准请到上方自行免费下载完整标准文档。