本标准规定了含乳酸菌食品中乳酸菌（lactic acid bacteria）的检验方法。本标准适用于含活性乳酸菌的食品中乳酸菌的检验。 GB 4789.35-2010 食品微生物学检验 乳酸菌检验 GB4789.35-2010 标准下载解压密码：www.bzxz.net

中华人民共和国国家标准
GB4789.352010
食品安全国家标准
食品微生物学检验乳酸菌检验
National food safetystandardFood microbiological examination: Lactic acid bacteria2010-03-26发布
中华人民共和国卫生部
2010-06-01实施
GB4789.35—2010
本标准代替GB/T4789.35-2008《食品卫生微生物学检验食品中乳酸菌检验》。
本标准与GB/T4789.35-2008相比，主要变化如下：修改了乳酸菌总数、乳杆菌、双歧杆菌和嗜热链球菌的计数方法。本标准的附录A为规范性附录。
本标准所代替标准的历次版本发布情况为：GB4789.35-1996、GB/T4789.35-2003、GB/T4789.35-2008。1范围
食品安全国家标准
食品微生物学检验乳酸菌检验
本标准规定了含乳酸菌食品中乳酸菌（lacticacidbacteria）的检验方法。本标准适用于含活性乳酸菌的食品中乳酸菌的检验。2规范性引用文件
GB4789.35—2010
本标准中引用的文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本标准。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。3术语和定义
3.1乳酸菌lacticacidbacteria
类可发酵糖主要产生大量乳酸的细菌的通称。本标准中乳酸菌主要为乳杆菌属（Lactobacillus）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）和链球菌属（Streptococcus）。设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：4.1恒温培养箱：36℃±1℃。
4.2冰箱：2℃~5℃。
4.3均质器及无菌均质袋、均质杯或灭菌乳钵。4.4天平：感量0.1g。
4.5无菌试管：18mm×180mm、15mm×100mm4.6无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。4.7无菌锥形瓶：500mL、250mL。5培养基和试剂
5.1MRS（ManRogosaSharpe）培养基及莫匹罗星锂盐（Li-Mupirocin）改良MRS培养基：见附录A中A.1。
5.2MC培养基（ModifiedChalmers培养基）：见附录A中A.2。5.30.5%蔗糖发酵管：见附录A中A.3。5.40.5%纤维二糖发酵管：见附录A中A.3。0.5%麦芽糖发酵管：见附录A中A.3。5.5
0.5%甘露醇发酵管：见附录A中A.3。5.70.5%水杨苷发酵管：见附录A中A.3。5.8
30.5%山梨醇发酵管：见附录A中A.3。5.9
0.5%乳糖发酵管：见附录A中A.3。5.10七叶苷发酵管：见附录A中A.4。5.11革兰氏染色液：见附录A中A.5。2莫匹罗星锂盐（Li-Mupirocin）：化学纯。5.12
GB4789.35—2010
检验程序
乳酸菌检验程序见图1。
样品25g（mL）+225mL无菌生理盐水10倍系列稀释
选择2个～3个适宜稀释度，
各以0.1mL加入到MRS平板
进行涂布
厌氧，
36℃±1℃,
48h±2h
乳酸菌总数计数
7操作步骤
7.1样品制备
选择2个～3个适宜稀释度，各以0.1mL加入到莫匹罗星锂盐
（Li-Mupirocin）改良MRS平板进行涂布厌氧，
36℃±1℃，
48h±2h
双歧杆菌计数
GB4789.35—2010
选择2个~3个适宜稀释度，
各以0.1mL加入到MC平板
进行涂布
需氧，
36℃±1℃，
48h±2h
嗜热链球菌计数
挑取双歧杆菌或乳杆菌菌落接种于MRS琼脂平板，嗜热链球菌接种于MC琼脂平板（可选做）菌种鉴定
图1乳酸菌检验程序图
7.1.1样品的全部制备过程均应遵循无菌操作程序。乳杆菌计数
乳酸菌总数减去双歧杆菌
与嗜热链球菌计数之和
7.1.2冷冻样品可先使其在2℃～5℃条件下解冻，时间不超过18h，也可在温度不超过45℃的条件解冻，时间不超过15min。
GB4789.35—2010
7.1.3固体和半固体食品：以无菌操作称取25g样品，置于装有225mL生理盐水的无菌均质杯内，于8000r/min~10000r/min均质1min~2min，制成1:10样品匀液；或置于225mL生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min制成1:10的样品匀液。7.1.4液体样品：液体样品应先将其充分摇匀后以无菌吸管吸取样品25mL放入装有225mL生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分振摇，制成1:10的样品匀液。7.2步骤
7.2.1用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于装有9mL生理盐水的无菌试管中（注意吸管尖端不要触及稀释液），振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。
7.2.2另取1mL无菌吸管或微量移液器吸头，按上述操作顺序，做10倍递增样品匀液，每递增稀释一次，即换用1次1mL灭菌吸管或吸头。7.2.3乳酸菌计数
7.2.3.1乳酸菌总数
根据待检样品活菌总数的估计，选择2个～3个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取0.1mL样品匀液分别置于2个MRS琼脂平板，使用L形棒进行表面涂布。36℃±1℃，厌氧培养48h+2h后计数平板上的所有菌落数。从样品稀释到平板涂布要求在15min内完成。7.2.3.2双歧杆菌计数
根据对待检样品双歧杆菌含量的估计，选择2个～3个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取0.1mL样品勾液于莫匹罗星锂盐（Li-Mupirocin）改良MRS琼脂平板，使用灭菌L形棒进行表面涂布，每个稀释度作两个平板。36℃±1℃，厌氧培养48h+2h后计数平板上的所有菌落数。从样品稀释到平板涂布要求在15min内完成。
7.2.3.3嗜热链球菌计数
根据待检样品嗜热链球菌活菌数的估计，选择2个～3个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取0.1mL样品匀液分别置于2个MC琼脂平板，使用L形棒进行表面涂布。36℃±1℃，需氧培养48h±2h后计数。嗜热链球菌在MC琼脂平板上的菌落特征为：菌落中等偏小，边缘整齐光滑的红色菌落，直径2mm土1mm，菌落背面为粉红色。从样品稀释到平板涂布要求在15min内完成。7.2.3.4乳杆菌计数
7.2.3.1项乳酸菌总数结果减去7.2.3.2项双歧杆菌与7.2.3.3项嗜热链球菌计数结果之和即得乳杆菌计数。免费标准bzxz.net
7.3菌落计数
可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（colony-formingunits，CFU）表示。7.3.1选取菌落数在30CFU～300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于300CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。
7.3.2其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数：若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。
7.3.3当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。4
7.4结果的表述
GB4789.35—2010
7.4.1若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g（mL）中菌落总数结果。7.4.2若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式（1）计算：N=Ec
/(n+0.1nz)d
式中：
N样品中菌落数：
ZC—平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；ni——第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；n2第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；d稀释因子（第一稀释度)。
7.4.3若所有稀释度的平板上菌落数均大于300CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。7.4.4若所有稀释度的平板菌落数均小于30CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
7.4.5若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。7.4.6若所有稀释度的平板菌落数均不在30CFU～300CFU之间，其中一部分小于30CFU或大于300CFU时，则以最接近30CFU或300CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。7.5菌落数的报告
7.5.1菌落数小于100CFU时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。7.5.2菌落数大于或等于100CFU时，第3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。7.5.3称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告。8结果与报告
根据菌落计数结果出具报告，报告单位以CFU/g（mL）表示。9乳酸菌的鉴定（可选做）
9.1纯培养
挑取3个或以上单个菌落，嗜热链球菌接种于MC琼脂平板，乳杆菌属接种于MRS琼脂平板，置36℃±1℃厌氧培养48h。
9.2鉴定
9.2.1双歧杆菌的鉴定按GB/T4789.34的规定操作。9.2.2涂片镜检：乳杆菌属菌体形态多样，呈长杆状、弯曲杆状或短杆状。无芽胞，革兰氏染色阳性。嗜热链球菌菌体呈球形或球杆状，直径为0.5um～2.0um，成对或成链排列，无芽胞，革兰氏染色阳性。9.2.3乳酸菌菌种主要生化反应见表1和表2。5
常见乳杆菌属内种的碳水化合物反应表1
干酪乳杆菌干酪亚种（L.caseisubsp.casei）德氏乳杆菌保加利亚种（L.delbrueckiisubsp.bulgaricus）嗜酸乳杆菌（L.acidophilus）
罗伊氏乳杆菌（L.reuteri）
鼠李糖乳杆菌（L.rhamnosus）
植物乳杆菌（L.plantarum）
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水杨苷
山梨醇
注：+表示90%以上菌株阳性：一表示90%以上菌株阴性：d表示11%～89%菌株阳性：ND表示未测定。表2
嗜热链球菌（S.thermophilus）菊糖
嗜热链球菌的主要生化反应
注：+表示90%以上菌株阳性：一表示90%以上菌株阴性甘露醇
水杨苷
山梨醇
马尿酸
棉子糖
A.1MRS 培养基
蛋白陈
牛肉粉
酵母粉
葡萄糖
吐温80
K,HPO4-7H20
醋酸钠·3H20
柠檬酸三铵
MgSO4-7H,0
MnSO4-4H20
琼脂粉
A.1.2制法
附录A
（规范性附录）
培养基及试剂
GB4789.35—2010
将上述成分加入到1000mL蒸馏水中，加热溶解，调节pH，分装后121℃高压灭菌15min～20minA.1.3莫匹罗星锂盐（Li-Mupirocin）改良MRS培养基A.1.3.1莫匹罗星锂盐（Li-Mupirocin）储备液制备：称取50mg莫匹罗星锂盐（Li-Mupirocin）加入到50mL蒸馏水中，用0.22um微孔滤膜过滤除菌。A.1.3.2制法
将A.1.1成分加入到950mL蒸馏水中，加热溶解，调节pH，分装后于121℃高压灭菌15min~20min。临用时加热熔化琼脂，在水浴中冷至48℃，用带有0.22um微孔滤膜的注射器将莫匹罗星锂盐（Li-Mupirocin）储备液加入到熔化琼脂中，使培养基中莫匹罗星锂盐（Li-Mupirocin）的浓度为50μg/mL。
MC培养基
A.2.1成分
大豆蛋白陈
牛肉粉
酵母粉
葡萄糖
碳酸钙
蒸馏水
1%中性红溶液
1000mL
A.2.2制法
GB4789.35—2010
将前面7种成分加入蒸馏水中，加热溶解，调节pH，加入中性红溶液。分装后121℃高压灭菌15min~20 min。
3乳酸杆菌糖发酵管
A.3.1基础成分
牛肉膏
蛋白陈
酵母浸膏
吐温80
1.6%溴甲酚紫酒精溶液
蒸馏水
A.3.2制法
1000mL
按0.5%加入所需糖类，并分装小试管，121℃高压灭菌15min～20min。A.4七叶苷培养基
A.4.1成分
蛋白陈
磷酸氢二钾
七叶苷
枸橡酸铁
1.6%溴甲酚紫酒精溶液
蒸馏水
A.4.2制法
将上述成分加入蒸馏水中，加热溶解，121℃高压灭菌15min～20min。A.5革兰氏染色液
A.5.1结晶紫染色液
A.5.1.1成分
结晶紫
95%乙醇
1%草酸铵水溶液
A.5.1.2制法
将结晶紫完全溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。A.5.2革兰氏碘液
A.5.2.1成分
碘化钾
蒸馏水
A.5.2.2制法
将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300mL。A.5.3沙黄复染液
A.5.3.1成分
95%乙醇
蒸馏水
A.5.3.2制法
将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。A.5.4染色法
A.5.4.1将涂片在酒精灯火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1min，水洗。A.5.4.2滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗GB4789.35—2010
A.5.4.3滴加95%乙醇脱色，约15s～30s，直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗。A.5.4.4滴加复染液，复染1min。水洗、待干、镜检9
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