GB 5413.17-2010 食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中泛酸的测定 GB5413.17-2010 标准下载解压密码：www.bzxz.net

中华人民共和国国家标准
GB5413.17—2010
食品安全国家标准
婴幼儿食品和乳品中泛酸的测定National food safety standardDetermination of pantothenic acid in foods for infants and young childrenmilkandmilkproducts
2010-03-26发布
中华人民共和国卫生部
2010-06-01实施
GB5413.17—2010www.bzxz.net
本标准第一法为等同采用国际分析家学会（AOAC）945.74PantothenicAcidinVitaminPreparations。本标准代替GB/T5413.17-1997《婴幼儿配方食品和乳粉泛酸的测定》。本标准与GB/T5413.17-1997相比，第一法主要变化如下：增加了tris缓冲液配制方法；
确定了测定波长：
增加了标准曲线绘制的文字描述。第二法主要变化如下：
更换了色谱柱；
改变了流动相：
-增加了含淀粉类试样进行酶解的处理方法。本标准的附录A为资料性附录。
本标准所代替标准的历次版本发布情况为：GB5413-1985、GB/T5413.17-1997。-
1范围
食品安全国家标准
婴幼儿食品和乳品中泛酸的测定本标准规定了婴幼儿食品和乳品中泛酸的测定方法。本标准适用于婴幼儿食品和乳品中泛酸的测定。2规范性引用文件
GB5413.17—2010
本标准中引用的文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本标准。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。第一法微生物法
3原理
利用植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）ATCC8014对泛酸的特异性，在含有泛酸样品中生长产生的酸度和形成的光密度来测定泛酸的含量。4试剂和材料
除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯试剂，水为GB/T6682规定的二级水。4.10.9%生理盐水：9.0g氯化钠溶解于1000mL水中，分装于具塞试管中，每管10mL，121℃灭菌15min。每周准备一次。
4.2泛酸钙标准品。
4.3乙酸溶液（0.2mol/L）：吸取12mL冰乙酸用水稀释至1000mL。4.4甲苯（CHg）。
4.5乙酸钠溶液（0.2mol/L）：溶解16.4g无水乙酸钠于水中，稀释至1000mL。4.6菌株：植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）ATCC8014。4.7培养基
4.7.1乳酸杆菌琼脂培养基：光解陈15g，酵母浸膏5g，葡萄糖10g，番茄汁100mL，磷酸二氢钾2g，聚山梨糖单油酸酯1g，琼脂10g，加蒸馏水至1000mL，调pH至6.8±0.2（20℃～25℃）。4.7.2乳酸杆菌肉汤培养基：光解陈15g，酵母浸膏5g，葡萄糖10g，番茄汁100mL，磷酸二氢钾2g，聚山梨糖单油酸酯1g，加蒸馏水至1000mL，调pH至6.8±0.2（20℃～25℃）。4.7.3泛酸测定用培养基：葡萄糖40g，乙酸钠20g，无维生素酸水解酪蛋白10g，磷酸氢二钾1g磷酸二氢钾1g，L-胱氨酸0.4g，L-色氨酸0.1g，硫酸镁0.4g，氯化钠20mg，硫酸亚铁20mg，硫酸锰20mg，硫酸腺嘌呤20mg，盐酸鸟嘌呤20mg，尿嘧啶20mg，胡萝卜素400μg，盐酸硫胺素200μgGB5413.17—2010
生物素0.8μg，p-氨基苯甲酸200μg，烟酸1mg，盐酸吡哆醇800μg，聚山梨糖单油酸酯0.1g，加蒸馅水至1000mL，调pH至6.7±0.1（20℃~25℃）。4.8Tris缓冲液：称取24.2gTrizmaBase于烧杯中，加200mL水溶解。4.9盐酸（0.1mol/L）：吸取8.3mL盐酸，用水稀释至1000mL。4.10标准溶液
4.10.1泛酸标准贮备液（40μg/mL）：精确称取45mg~55mg泛酸钙标准品（4.2），溶入500mL蒸馏水中，加10mL乙酸溶液（4.3），加100mL乙酸钠溶液（4.5），用水稀释至泛酸钙精确浓度为43.47μg/mL（即泛酸浓度为40μg/mL），加0.5mL甲苯（4.4）贮于2℃～4℃冰箱中，保存期为4个月。
4.10.2泛酸中间贮备液（1μg/mL）：取25mL标准贮备液（4.10.1），加入蒸馏水500mL，乙酸溶液10mL（4.3），乙酸钠溶液100mL（4.5），再用水稀释至1L。加0.5mL甲苯（4.4）贮于冰箱中（2℃～4℃），保存期为1个月。
4.10.3泛酸标准工作液（10ng/mL，5ng/mL）：吸两次5.0mL中间贮备液（4.10.2），分别用水定容至500mL和1000mL，临用前配制。5仪器和设备
5.1分光光度仪。
5.2pH计：精度为0.01。
5.3涡旋振荡器。
5.4天平：感量0.1mg。
5.5生化培养箱：36℃±0.5℃。5.6离心机：转速≥2000转/分钟。6分析步骤
6.1测试菌液的制备
6.1.1把植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）ATCC8014冻干菌粉转入乳酸杆菌肉汤培养基（4.7.2）试管中，36℃±1℃培养24h。再转接至乳酸杆菌琼脂培养基（4.7.1）试管中，36℃±1℃培养24h培养好的乳酸杆菌琼脂培养基（4.7.1）试管的培养物作为贮备菌种。6.1.2从贮备菌种培养基上分别转接到三个乳酸杆菌琼脂培养基（4.7.1）试管中，放入培养箱中36℃±1℃培养24h。每月转接一次，作为月接种管赔于冰箱中。每月定期从月接种管中重新接种3个转接管保存新菌株。
6.1.3从月接种的培养管中的一支再接种一支乳酸杆菌琼脂培养基（4.7.1）试管，36℃±1℃培养24h作为日接种管每日测定用。
6.1.4从日接种管中接种一管乳酸杆菌肉汤培养基（4.7.2），36℃±1℃培养24h。在无菌条件下离心该培养液10min（2000转/分钟），弃去上清液。用10mL生理盐水（4.1）振荡洗涤菌体，离心10min（2000转/分钟），弃去上清液，用10mL生理盐水（4.1）振荡清洗。如前离心操作，弃去上清液。再加10mL生理盐水（4.1），混匀。吸1mL该菌悬液于10mL生理盐水（4.1）中，混匀制成测试菌液。2
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6.1.5以生理盐水（4.1）做对照，在分光光度计550nm波长下，测测试菌液（6.1.4）的光密度值，称取2g（精确至0.0001g）固态试样或5g（精确至0.0001g）液态试样（约含泛酸0.1mg）于250mL三角烧杯中。加入10mLTris缓冲液（4.8），再加入少量水，121℃水解15min，冷却。用盐酸（4.9）调pH至4.50.2，转入250mL容量瓶中用水定容。过滤，吸4mL滤液，稀释至泛酸的浓度约为5ng/mL。按表1顺序加入蒸馏水、标准溶液和培养基于试管中，表1中每一编号需制作3管。试管S2至S10中，相当泛酸含量为0ng、5ng、10ng、15ng、20ng、25ng、30ng、40ng、50ng。此值应在60%～80%之间。
6.2试样的处理
6.3标准曲线的制作
将标准曲线管和试样管121℃灭菌5min，迅速冷却到室温（商品化培养基按标签说明进行灭菌）。4
在无菌条件下每管中均加入一滴（约50μL）测试菌液（6.1.4），加盖，充分振荡混匀所有试管（标4
36℃±0.5℃培养16h～24h。对每个试管进行目测检查，未接种管中培养液应是澄清的，标准曲S7
注：保证加热和冷却过程中条件均匀，灭菌管数过多或距离太近，在灭菌锅中都可产生不良影响。S6
表1标准曲线管制作
按表2顺序加入蒸馏水、试样和培养基于试管中，一式三份。3
线管和试样管中培养液的浊度应有梯度。未接种管中若出现混浊，则测定无效。表2试样管的制作
注1：试管S3～S7中加低浓度的为标准溶液。注2：试管S8～S10中加高浓度的为标准溶液。5
蒸馏水（mL）
标准溶液（mL）
6.4试样管的制作
试管号
培养基（mL）
准曲线未接种空白管S1除外）。蒸馏水（mL）
试管号
试样（mL）
培养基（mL）
6.5灭菌
6.6接种
6.7培养
6.8测定
GB5413.17—2010
以接种空白管（表1中试管号S2）做对照，取出最高浓度标准曲线管S7，振荡5s，在波长550nm条件下读取光密度值，放回重新培养。2h后同等条件重新测该管的光密度，如果两次光密度的绝对差结果≤2%，则取出全部检验管测定标准溶液和试样的光密度。6.9标准曲线的绘制
以标准曲线管泛酸含量作横坐标，以光密度值为纵坐标绘制标准曲线。6.10试样管中泛酸含量的计算
按照6.8每个试样管测定的光密度值，从标准曲线中查得对应的泛酸含量。每一编号的三个试样管应计算管中每毫升测定液泛酸的含量，并与三者平均值相比较。相对偏差小于15%的试管为有效试管，无效试样管应舍去。有效试样管总数应大于所有试样管总数的2/3。重新计算每一编号的有效试样管中每毫升测定液泛酸含量的平均值，以此平均值计算全部编号试样管的总平均值Cx。注：样品管中泛酸含量低于5ng，高于50ng的值应舍去。7分析结果的表述
试样中泛酸含量按式（1）计算：C
式中：
X试样中泛酸含量，单位为微克每百克（μg/100g）：Cx6.10中计算所得的总平均值，单位为微克（μg）：稀释倍数；
m—试样的质量，单位为克（g）。以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。8精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%，第二法
9原理
高效液相色谱法
试样经热水提取等前处理后，经C18色谱柱分离，紫外检测器检测，外标法定量泛酸的含量。10试剂和材料
除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。10.1淀粉酶：酶活力≥1.5U/mg。10.2甲醇(CH4O)：色谱纯。
10.3盐酸。
10.4硫酸锌(ZnSO4)。
GB5413.172010
10.5盐酸（0.1mol/L）：移取8.3mL盐酸（10.3）于1000mL容量瓶中，用水定容。10.6硫酸锌溶液（15g/100mL）：称取15g硫酸锌（10.4）用水溶解并定容至100mL。10.7磷酸二氢钾溶液（0.05mol/L）：称取6.8g磷酸二氢钾，用水溶解并定容至1000mL。用磷酸调节pH至3.0，用0.45um滤膜过滤。10.8泛酸标准溶液
10.8.1泛酸标准储备液（1mg/mL）：准确称取泛酸钙1.087g，加水溶解并定容至1000mL。泛酸浓度=泛酸钙浓度×0.920
10.8.2泛酸标准中间液（0.1mg/mL）：吸取标准储备液（10.8.1）10mL于100mL容量瓶中，加水定容。临用前配制。
11仪器和设备
11.1天平：感量为0.1mg
11.2高效液相色谱仪，带紫外检测器。11.3超声波。
11.4pH计：精度为0.01。
11.5培养箱：55℃±2℃。
12分析步骤
12.1试样处理
12.1.1不含淀粉类试样处理
称取混合均匀的固态试样约5g（精确至0.0001g）或液态试样约20g（精确至0.0001g）于150mL三角瓶中，固体试样加入约30mL40℃～50℃温水，振摇溶解后超声萃取20min，12.1.2含淀粉类试样处理
如果试样中含有淀粉，称取混合均匀的固态试样约5g（精确到0.0001g）或液态试样约20g（精确到0.0001g）于150mL三角瓶中，加入淀粉酶（10.1）约0.2g，固体试样加入约30mL40℃～50℃温水振摇溶解，盖上瓶塞，在50℃～60℃条件下酶解30min。12.2测定液的制备
试样溶液降至室温后，用盐酸（10.5）调节pH至4.5±0.1，加入5mL硫酸锌溶液（10.6），充分混合。转入50mL容量瓶中，用水定容至刻度并充分混勾后，用滤纸过滤。滤液经0.45μum滤膜过滤后，即为试样待测液。
12.3参考色谱条件
色谱柱：ODS-C18（粒径5um，250mmx4.6mm）或具有同等性能的色谱柱。流动相：取磷酸二氢钾溶液（10.7）900mL，取甲醇（10.2）100mL，混匀后经0.45μm微孔滤膜加压过滤。
流速：1.0mL/min。
检测波长：200nm。
柱温：30℃±1℃。
进样量：10μL。
12.4测定
12.4.1标准曲线测定
GB5413.17—2010
分别准确吸取泛酸标准中间液（10.8.2）1.0mL，2.0mL，4.0mL，8.0mL，12.0mL于100mL容量瓶中，加水定容至刻度，得到浓度分别为1.0μg/mL，2.0μg/mL，4.0μg/mL，8.0μg/mL，12.0μg/mL的泛酸标准工作液，临用前配制。将上述泛酸标准工作依次进行色谱测定（其标准样品色谱图见附录A中图A.1），记录色谱峰高（或峰面积）。以峰高（或峰面积）为纵坐标，以标准工作液浓度为横坐标绘制标准曲线。12.4.2试样溶液的测定
吸取试样待测液（12.2）10L，将试样待测液进行色谱测定，从标准曲线中查得试液中泛酸的浓度。
分析结果的表述
试样中泛酸的含量按式（2）计算：V×C×K
式中：
X试样中泛酸含量，单位为微克每百克（μg/100g）试样溶液中泛酸的质量浓度，单位为微克毫升（μg/mL）：C
称取试样的质量，单位为克（g）；-被测样液总体积，单位为毫升（mL）；K-样液稀释倍数。
以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。15其他
本标准第二法检出限为100μg/100g。·（2）
A.1泛酸标准溶液的液相色谱图
附录A
（资料性附录）
泛酸标准溶液的液相色谱图
泛酸标准溶液的液相色谱图见图A.1。o
月2-1
泛酸标准溶液的液相色谱图
GB5413.17—2010
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