GB/T 24894-2010 动植物油脂 甘三酯分子2-位脂肪酸组分的测定 GB/T24894-2010 标准下载解压密码：www.bzxz.net

ICS 67. 200. 10
中华人民共和国国家标准
GB/T 24894—2010/IS06800:1997动植物油脂
甘三酯分子2-位脂肪酸组分的测定Animal and vegetable fats and oils--Determination of the composition of fatty acids in the2-position of the triglyceride molecules(1SO 6800:1997,IDT)
2010-06-30发布
中华人民共和国国家质量监督检验捡疫总局中国国家标准化管理委员会
今伴网
2011-01-01实施
GB/T24894—2010/ISO6800:1997本标准等同采用国际标准IS06800：1997《动植物油脂甘三酯分子2-位脂肪酸组分的测定》(英文版）。
本标准的内容和结构与ISO6800：1997一致，作了如下编辑性修改：“本国际标准”一词改为“本标准”；用小数点“，”代替作为小数点的逗号“，\；·删除国际标准的前言；
在规范性引用文件中”，用GB/T5530动植物油脂酸值和酸度测定》代替ISO660：1996Animal and vegetable fzts and oils—Determination of acid value anl of acidity:用 GB/T 6682《分析实验室用水规格和试验方法》代替ISO3696：1987Water for analytical taboratoryusc-Specilication and test methods；用GB/T15687《动植物油脂试样的制备》代替Animal and vegetable fats and oils-Prcparation of test sample; 用ISO 661:1989
GB/T17376《动植物油脂脂肪酸中酯制备》代替ISO5509：1978Animalandvegetablefatsand oilsPreparation of methyl esters of fattyacids;用GB/I17377《动植物油脂脂肪酸甲酯的气柑色谱分析》代替IS05508：1990Anitnal und vcgctablefats and oilsAnalysisbygas chrornatography of methyl esters of fatty acids.本标准的附录A为规范性附录，附录B为资料性附录。本标准出国家粮食局提出。此内容来自标准下载网
本标准由全国油标准化技术委员会归口。本标准起草单位：国家粮食局科学研究院。本标雅主耍起草人：栾霞、王瑛瑶、张惑、辟雅琳，httr
1范围
动植物油脂
GB/T24894—2010/ISO6800:1997甘三酯分子2-位脂肪酸组分的测定本标准规定了动植物油脂中甘三酯分子2-位脂肪酸（或内位）组分的测定。由于映脂酶的活性，本方法只适用于熔点45“C以下的油脂。本方法不适用于含有下列组分的油脂：：一含有十二或更少碳原子的脂肪酸（如：椰子油、棕榈仁油、黄油）：一含有二十碳或更多碳原子的高度不饱和脂肪酸（多于四个双键)（如：鱼油和游生动物油）：一含有氧化次基团的脂肪酸。
注：双健位景在n-6至n-11的脂肪酸（如：岩芹酸）被胰脂藓酶解速度非常慢，可能引起错误结果。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标推的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T5530动植物油脂酸值和酸度测定（GB/T5530-2005，ISO660：1996，IDT）GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T66822008,ISO3696：1987,MOD）GB/T15687动植物油脂试样的制备（G1/T15687—2008，ISO661:2003,IDT）GB/T17376动植物油脂脂防酸甲酯制备（GB/T17376--2008，ISO5509：2000，IDT）GB/T17377动植物油脂脂肪酸甲酯的气相色谱分析（GB/T17377—2008ISO6508:1990，IDT)
3原理
试样中游离脂肪酸中和后，经柱层析净化，用酶将廿点酯水解成2-单甘醋，经薄层层析(TLC)分离，用气相色谱测定脂肪酸组分含量。4试剂
所有试剂均为分析级，水为符合GB/T6682要求的二级水。4.1用于试样净化的试剂
4.1.12-两醇或乙醇：95%（体积分数）。4.1.2正己烷或石油醚：沸程范围30℃~60℃。4.1.32-丙醇：50%（体积分数）或乙醇：50%（体积分数）。4.1.4氯氧化钠溶液：0.5mol/L。4.1.5酚酸溶液：1g酚酸溶于100mL95%(体积分数）乙醇中。4.1.6活化的中性氧化铅：用于柱层析。最近在260℃温度活化2h的中性氧化铝，达到活性I级，保存在干燥器中。
4.1.7氮气。
4.2用于甘三酯水解的试剂
4.2.1乙醚：不含过氧化物。
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GB/T 24894—2010/ISO 6800:19974.2.2盐酸:6mo1/l.。
4.2.3肥酸钠溶液：1g/1。
4.2.4钙溶液：220g/L（生化试剂）。4.2.5缓冲溶液：1nal/I.兰羟甲基氮基甲烷（别名：三羟甲基甲胺、2-氨基-2-丙基-1,3-二醇)溶液。用盐酸(4.2.2)谢节至pH8(用pH计测量）。溶液在0℃～4℃条件下存，保存期14天。4.2.6胰脂酶：活性8单位/mg～20单位/tmg。储存在干燥的冰箱里。使用前取出所需粉状品，使其温度达到室温。
注：可使用有良好活性的市售脂肪酶，也可按附录A步骤制备脂舫酶，并检测脂防酶活性。4. 3用于分离 2-单甘酯的试剂
4.3.1乙醇：95%（体积分数）。4.3.2正己烷或石油醚：沸程范围30℃~60℃4.3.3 丙酮。
4.3.4硅胶：含有粘合剂，用于薄层层析，4.3.5展开剂：正已烧或石油醚+乙醚+98%甲酸=70+30+1。4.3.6显示剂：2',7-_氯荧光黄乙醇溶液（2'7-Dichlurofluoresccin）：2g/L，100mL溶液加1滴1 mol/1.氢氧化钠溶液使呈微碱性4.4用于气相色谱分析2-单甘酯的试剂参见GB/T 17376 和 GI3/T 17377。5仪器
实验空常用仪器设备，特别是下列仪器设备：5.1用于净化样品的器
5.1.1水浴锅：在30℃~40℃之间能恒温控制。5.1.2层析柱：用于层析分离，内径13mm、长400mm的玻璃管，配有烧结玻璃过滤板和活塞开关。5.1.3旋转蒸发器：配有250mL圆底烧瓶。5.1.4氟吹仪：提供氮气流，
5,1.5 分液漏斗:500 mLa
5,1.6圆底烧瓶：100mL
5. 2用于甘三酯水解的仪器
5.2.1离心机，
5.2.2玻璃离心管:10 mL,带有磨口玻璃塞。5.2.3电动振荡器：能使离心管激烈摇动。5.2.4水浴锅：可恒温控制.温度保持在40℃士0.5℃。5.2.5注射器,1 mL,配有细针头。5.2.6秒表。
5. 3用于分离 2-单甘酯的仪器
展开槽：用于薄层层析，带有磨砂玻璃盖，适合于200mm×200mm玻璃板：5.3.1
5.3.2涂布器：用于制备薄层层析板。5.3.3玻璃板:200mm×200mm。
5. 3. 4 微量注射器:3 μL/滴~4 μL/滴。5.3.5喷雾器：用下薄层层析板喷射显示剂。5.3.6
微型刮铲用于刮下薄层层析板上单廿酯谱非。5,3.7
烘箱：保持温度103℃士2℃
ht
5.3.8紫外光灯：检测薄层板上的谱带，波长254nm5.3.9圆底烧瓶，25mL，配有磨口接头的1㎡长空气冷器。5.3.10锥形瓶：250mL,带有磨口玻塞。5.3.11锥形瓶：50mL。
5.3.12玻璃过滤器：烧结玻璃的孔隙为16μm~40μm。5.3.13干燥器：内有有效的下燥剂。5.4用于气相色谱法分析2-单甘酯的仪器参见GB/T17376和CB/T17377.
6取样
GB/T 24894—2010/IS06800:1997十分重要的是实验室收到的样品必须有真实代表性，并在运输和贮存期间不得有损坏和变化。扦样不是本标准规定的内容，推荐采用GB/T5524规定的方法托样。7试样制备
按GB/T15687规定的步骤制备试样。8分析步骤
注：如果要检查测试结果是否满足重复性要求（见10.2)，可按分析步骤8.1～8.6进行两个单独测定。8.1试样酸值的测定
试样酸值按GB/T5530测定。如果酸值低丁3%（质量分数），可按8.3直接通过氧化铝层析柱净化试样；如果酸值高于3%（质量分数），先按8.2在有溶剂存在的情况下用氢氧化钠中和，然后按8.3氧化铝层析柱净化试样。
8.2氢氧化钠中和
将约10g的油样溶解于100mL正已烧或石油醚（1.1.2）中，转入分液漏斗（5.1.5）。加50mL2-丙醇或乙醇（4.1.1)，儿滴酚酸溶液（4.1.5)，加人中和油样游离脂肪酸所需的氢氧化钠溶液（4.1.4)并超量0.5%。用力振摇1min，加50mL蒸馏水再振摇，然后静置。分层后，弃去下层皂液和中间层（粘液和不溶于水的物质）。逐次用25ml.～301nL的2-丙醇或乙醇溶液（4.1.3）清洗中和油脂的正己烷或石油醛，直至酚酸的粉红色消失为止：将溶液转移到旋转蒸发器（5.1.3)的底瓶中，在减压条件下去除大部分正已烷或石油醚。减压并通人氮气流（4.1.7）、在30℃～40℃条件下，于燥油脂，直到溶剂完全除去为止。8.3氧化铝层析柱净化试样
15g已活化的氧化铝（4.1.6)与50mL正已烷或石油醚(4.1.2)制备成悬浮液，边振动边倒人层析柱（5.1.2）中，确保氧化铝均勾沉降。当溶剂液面下降到吸附剂以上1mm~2mm时，把用25mL正已烷或石油醛（4.1.2)溶解的5g油脂溶液，小心地倒人层析柱里，用100mL圆底烧瓶（5.1.6）收集从层析柱流出的洗涤液。
减压蒸馏去除大部分溶剂.充入氮气流（4.1.7），在30℃～40℃温度下于燥油脂，直到溶剂完全除去为止。
8.4 水解甘三酶
8.4.1称取约0.1净化的试样(8.3)置于10mL离心管（5.2.2)中。如果室温下试样不是液体，将离心管置于60℃～65℃的水浴锅内，如果试样还不完全液化，继续浸在水浴中，但不超过10s。从水浴锅中取出离心管,迅速进行 8.4.2到8.1.5步骤操作。8.4.2向已液化的试样加入已预先称重的约20 mg脂肪酶(4. 2.6)和2 mL缓冲熔液(4.2.5)。小心摇动，然后加人0.5ml.的胆酸钠浴液（4.2.3)和0.2mL氯化钙溶液（4.2,4)盖上塞子小心摇动。这3
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GB/T24894—-2010/1S06800:1997些操作步骤应在30s内完成，立即将管子放入40℃水锅内，保持手摇60士2s。8.4.3从水浴锅中取出离心管，在40℃下，用振荡器（5.2.3)烈摇动120s十2s。8.4.4立即加人1mL盐酸（1.2.2)和1mL乙醛（4.2.1）。盖上塞了,并用荡器(5.2.3)剧烈振摇。B,4.5离心分离，用注射器（5.2.5)将有机相转移到试管里。如果在坏境温度下试样是固态，再用 t乙醚浸取，提取物合并到试管中。8.5分离 2-单甘酯
8.5.1薄层板的制备
用乙醇（4.3.1)、正已烷或石油醚（4.3.2）和丙酮（4.3.3)小心清洗玻璃板（5.3.3），直到脂肪类物质彻底清除。称30g硅胶（4.3.4）装人250mL锥形瓶（5.3.10）中，加入60mL水。盖上塞了，邀烈摇动1min，立即将浆液倒人涂布器（5.3.2)上，在于净的玻板上涂上0.25mm厚的薄层。接着在空气中至少晾干1h。无论是按上述方法制备的薄层板，还是购买的薄层板，都需要在103℃烘箱中（5.3.7)烘1h，进行活化。使用前允许薄层板在干燥器（5.3.13)中冷却到室温。为避免酰基转移，硅胶板可用硼酸饱和处理。反应混合物应尽快进行薄板层析分离。山于一些硅胶含有可能影响脂肪分析的有机物，建议进行空自测试，确保没有这些物质存在。另外，事先把制备的薄层板放在展开槽中，用溶剂展开到薄层板的顶端加以清洗。8.5,22-单甘酯的分离
用微量注射器(5.3.4)将试样提取液(8.4.5)滴在距薄层板(8.5.1)底边15mm的位置，使细滴组成连续带。将薄层板放入展开（5.3.1)，展开槽享先加有展开剂（4.3.5），并已达到饱和状态。盖上盖子进行层析（层析温度约20℃），直到溶剂到达薄层板上沿10mm处为止。在约20℃温度的空气中干燥薄层板，用喷雾器（5.3.5)将显示剂(1.3.6）喷涂在薄层板上。在紫外光灯（5.3.8)下标出单甘酯的谱带（R，值约0.035），用微型刮铲（5.3.6)刮下，要避免刮到起点线上的物质。在案温下是液体的化试样（8.3），收集的硅胶移人烧瓶（5.3.9），按8.6步骤进行操作。在温下是固体的净化试样（8.3），收集到的硅胶移人50mL锥形瓶（5.3.11），加15mL艺醚（4.2.1），充分摇动。把所有硅胶移人烧结玻璃过滤器（5.3.12），每次用15mL乙醚冲洗过滤器，共三次。收集过滤液用旋转蒸发器除去乙醛至滤液体积为4mL5mL，将其转移到已称重的圆底烧瓶(5.3.9)中，用氨气除去余下的乙醚，称重并计算单甘酯的质量。单甘酯的量应占该试样量的10%～30%（质量分数）,否则要重新水解甘三酯（8.3)或检查脂肪酶活度（见附录A）。8. 6气相色谱法分析 2-单甘酯
收集硅胶所获得的单甘酯（或从硅胶中提取的单甘酯），按GB/T17376方法制备脂肪酸甲酯，采用三氟化硼常规法或中性油脂法。再按GB/T17377气相色谱法测定脂肪酸甲酯。9结果表示
计笋出各种2-单甘酯占总2-单甘酯的比值，以质量分数表示。结果保留一位小数。
10精密度
10.1实验室间测试结果
附录B汇总了本标准实验室间测试精密度的情况。这些测试结果得出的数值可能不适用于其他浓度范围和测试对象，
10.2重复性
在同一实验室，函同一操作若使用相间设备，按相同的测试方法，在短时间内两个独立测试结果的绝对差值不应超过：
脂肪酸酯含量<5%（质量分数)时，绝对差≤0.2%(质量分数）；4
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GB/T24894—2010/IS06800：1997脂肪酸酯含量5%（质量分数）时，毛细管柱法的绝对差≤1%（质量分数），填究柱法的绝对差≤3%（质量分数）。
10.3再现性
在不同的实验室，由不同的操作者使用不同的设备，按相同的测试方法，两个独立测试结果的绝对差值不应超过：
脂防酸酯含量5%（质量分数）时，绝对差≤0.5%（质量分数）；脂肪酸酯含量≥5%（质量分数）时，毛细管柱法的绝对差3%（质量分数），填充柱法的绝对差≤10%（质量分数）。
实验报告
实验报告应说明：
采样方法（如知道）；
所使用的方法；
测试结果，
“一如果逃行了重复性检验，提供最后结果；一本标准巾未指定或白选操作，以及可能影响结果的任何细节。实验报告应包括关于样品的所有信息。5
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GB/T24894—2010/ISO6800:1997A.1脂肪酶的制备
附录A
（规范性附录）
脂肪酶的制备和活性的测定
将5kg的鲜猪胰脏冻至0℃，除去周围的固体脂肪和连着的组织，在捣砖机中捣碎，获得糊状物。低温下加人2.5L尤水丙酮，搅拌4h～6h，然后离心分离。用同体积的丙酮苯取残留物三次以.上，然后用1十1的丙酮和乙醛混合液萃取两次，再用乙醚萃取两次。
在减压条件下于燥残留物481，获得稳定的粉状物为止，储存于冰箱中。A,2脂肪酶活性的测定
用165ml阿拉伯树胶溶液（100g/L）、15g碎冰和20ml.已中和的油脂，在合适的搅拌装置中，混合搅拌10mi，制备成乳化油。
腋10mL乳化油置于50mL烧杯中，依次加入0.3mL胆酸钠（200g/L）溶液和20mL蒸馏水。将烧杯置人37℃±0.5℃的水裕锅中（见注1。插人pH计的电极和螺旋浆搅拌器，用5mL滴定管一滴一滴地加入0.1tnol/I.氢氧化钠溶液，直到pH达到8.5。
加入足够量（见注2)精确体积的0.1%（质量分数）的脂肪酶粉末悬浮水溶液·刚加入时pH计仍显示pH8.3，立即启动秒表，滴人0.1mo1/L氢氧化钠溶液，维持pH8.3不变，记下每分钟所使用的碱溶液体积,约 10 min.
以时间为横坐标，以维持恒定pII所需碱溶液的毫升数为纵坐标，将测定值作图，所得形应是真线。
注1：液态油脂，水解温度选定37℃，熔点在45℃以下的脂肪，可选定40℃，以便进行测定。注2：脂肪醇惑浮液的用量，应使消格1ml.碱液约需4min~5min。一般需要2ml.～5mL脂肪酶悬浮液，也就是1 m&~5 g 的粉末。
脂肪酶单位规定为37℃和pH8.3条件下，每分钟释放1μmol酸的酶量。粉状物酶活性A(以脂肪酶单位每毫克表示),按式(A.1)计算：A=Vxc
武中：
V一从图形中算出的每分钟消耗氢氧化钠溶液的体积数，单位为毫升每分钟（mL/min）m—用于测试的脂肪酶粉状物的质量，单位毫克（ng）,所使用的脂肪酶活性应在8单位每毫克至20单位每克之闻：
氨氧化钠溶液浓度，单位为毫摩尔每升（mmoi/L)(c=100mmol/L)。E
B.1使用填充柱的方法
附景B
（资料性附录）
实验室间测试结果
GB/T24894--2010/SO6800:1997
实验室间测试在荷兰完成，参加实验室8个。对猪油、牛油、40%猪油和60%牛油的混合油样品进行测试，给出剔除离群值后的统计结果（根据ISO572521评价）见表B.1。测试结果用脂肪酸中甲酯的质量分数表示。
A猪油
脂肪酸
平均含量(质量分数）
重复性标准偏差（S.）
重复性变异系数/%
重复性限(r)
再现性标准偏差（S)
再现性变异系数/%
再现性履(R)
B)牛油
乎均含最(质量分数)
重复性标准偏差(S,)
重复性变异系数/%
重复性限()
再现性标准偏差（Ss）
再现性变异系数/%
再现性限（R)
C）猪油和牛油的混合油，40十60平均含量（质量分数）
重复性标准偏差(S,)
重复性变异系数/%
重复性限()
再现性标准偏养（SR）
再现性变异系数/%
再现性限(R)
B.2使用毛细管柱的方法
填充柱色谱测试猪油和牛油的统计结果Cusio
1993年，实验室间测试用3个橄榄油样品由AOCS/I0OC进行，24个实验室参加。表B.2给出甘三酷2位C1。和C18。脂肪酸组分含量的统计结果（根据ISO5725l.2评价）。7
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GB/T24894—2010/1S06800:1997毛细管柱色谱测试橄榄油的统计结果表B.2
别除离群值后实验室数
平均含盘(质基分数)
重复性标准偏差(S,）
重复性变异系数/%
重复性限()
再现性标推偏差（Ss）
再现性变异系数/%
再现性限(R)
http:
oodmate.net
鑫考文献
GB/T24894—2010/ISO6800：1997[1]GB/T5524—2008动植物油脂扦样（GB/T5524—2008,ISO55552001,IDT).[2 IS() 5725:1986 Precision of tes1 mcthods- Determinatian of repeatability and reproducibiliry for a standard test ncthod by inter-laharatary tests.9
http：//foodmate.netGB/T 24894-2010
打印日期：2010年9H21HF017
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中华人民共和国
国家标谁
动植物油脂
甘三酯分子 2-位脂肪酸组分的测定GB/T 248942010/1SO 6800:1997中国标准出版社出版发行
北京复兴门外三里河北街16号
邮政编码：100045
网址 spc, net, cn
电话：6852394668517548
中国标雅出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销
开本 880×1230 1/16
印张 1 字数 18千字
2010年8月第-一版
反2010年8月第一次印刷
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