GB/T 25228-2010 粮油检验玉米及其制品中伏马毒素含量测定免疫亲和柱净化高效液相色谱法和荧光光度法 GB/T25228-2010 标准下载解压密码：www.bzxz.net

ICS 67.040
中华人民共和国国家标准
GB/T25228—2010
粮油检验
含量测定
玉米及其制品中伏马毒素
免疫亲和柱净化高效
液相色谱法和荧光光度法
Inspection of grain and oils-Determination of fumonisins in corn andits products by high liquid chromatography and fluorometer withimmunoafrinity column cleanup2010-09-26 发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局国国家标准化管理委员会
2011-03-01实施
GB/T 25228—2010
本标准中的免疫亲和柱净化高效液相色谱法修改采用国际分析化学师协会的测定疗法《AOAC宫方方法 2001.04玉米和玉米片中伏码毒素的测定免疫亲和柱净化液相色谱法》(Official mcthod2001, 04 Determination of fumonisins I3 and B, in corn and corn flakes Liquid chromatography withimmunoaffinity column cleanup).为了便于使用，本标推对A0AC official method 200l.04进行了下列修改将适用测定浓度范围修改为检出限，删除了该标准中实验室间测试数据表A和表B,增加了国内实验室间测试数据：
修改了对免疫亲和柱的要求；
修改工标推曲线的浓度范闺；
将定容体积由200jl.改为400μL；-增加了空白试验；
简化了结果计算。
本标准的附录^、附录B和附录C为资料性附录。本标准山国家粮食局提出。
本标准由全国粮油标准化技术委员会归口。本标准负责起草单位：国家粮食局科学研究院。本标准参加起草单位：北京中检维康技术有限公司。本标推主婴起草人：十松雪，王雄、刘焰、张艳、孙长坡、工岩，httr
1范围
粮油检验玉米及基制品中伏马毒素含量测定免疫亲和柱净化高效
液相色谱法和荧光光度法
GB/T 25228—2010
本标准规定了采用免疫亲和柱净化高效液相色谱法和免疫亲和柱净化荧光光度法测定玉米及其制品中伏马毒素测定的原理、试剂和材料、仪器和设备、操作步及结果表示。本标准中免疫亲和柱净化高效液相色谱法适用了玉米和玉米制品中伏马毒素B,和B，的测定，免疫亲和柱净化荧光光度法适用于压米和退米制品中伏乌毒素总量的测定。免疫亲和柱净化高效液相色谱法的检测限为0.1加g/k名；免疫亲和柱净化荧光光度法的捡测限为0. 5 mg/kg。
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标推的引用而成为本标推的条款，凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用丁本标推，然而，鼓励根据本标准达成协议的齐方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3免疫亲和柱层析净化高效液相色谱法3.1原理
利用免疫亲和反应净化样品，以邻苯二甲醛柱前衍生伏马毒素为荧光化合物，用反相高效液相色谱进行分离，检测，外标法测定伏马毒素B，和B.的含量。3.2试剂和材料
除分有规定外，所用试剂均为分析继，实验用水应符合GB/T6682中二级水的要求。3.2.1甲醇：色谱纯，或纯度相当。3.2.2乙睛：色谱纯，或纯度相当。3.2.3磷酸二氢钠(NaII,PO.·2H.0)。四硼酸钠(NazB,O,·10H,O)。
5氯化钠。
3.2.6磷酸氢二钠。
3.2.7磷酸二氢钾。
氯化钾。
3.2.9浓盐酸。
3. 2. 10 磷酸。
3.2. 11邻苯二甲醛(()PA)。
3.2.122-硫基乙醇(MCE)。
3.2.130.1 mol/L磷较氢钠溶液:称取 15.6 g磷酸--氢钠(3.2.3),用水溶解并定容为 1 I。3.2.140.1mol/L四硼胶钠溶液：称取3.8g四硼酸钠（3.2.4),用水溶解并定容至100mL。3.2.152mol/L盐酸溶液：将1体积浓盐酸（3.2.9)溶解准5体积水中。1
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GB/T 252282010
3.2. 16提取溶液,瑕25 ml_ 甲醇(3.2. 1)圳人25 1ml.乙腈(3. 2.2)和50 mL水。3.2.17乙腈/水：取5ml.乙晴（3.2.2）加入5ml.水。3.2.18磷酸盐缓冲液（PBS）：将8.0g氯化钠（3.2.5）、1.2g磷酸氢二钠（3.2.6）.0.2g磷酸二氢钾(3.2.7).0.2g氯化钾（3.2.8）溶解下990ml.水中，用2mol/盐溶液（3.2.15）调节pH为7.0,最后楚容为 1I。
3.2.19流动相：甲醇（3.2.1)十0.1mo1/1.磷酸二氢钠浴液（3.2.13）=77123,用磷酸（3.2.10)谢节pH为3.34.0，用0.45μm滤膜（3.3.13)过滤3.2.20OPA衍生液：将40mgOPA（3.2.11)落解在1mL甲脖中，用0.1mal/1.NazB,O,溶液（3.2.14)5mL稀释。加2-硫齿Z醇（MCE)（3.2.12)50μI.，混勾。装于具塞棕色瓶中，室温避光处可以偌藏1周。
3.2.21伏马毒素B，和B.标准品：品体，纯度>95%。3.2.22伏马毒素标准储备液：准确称取适量伏马毒素B，和B标推品（3.2.21），用乙腈十水（3.2.17）溶解，配制成伏马毒素B，浓度为100p名/mL、伏马毒素13浓度为50μ/mL的混介标推溶液。该标准溶液在4℃下，可以稳定储藏6个。移取500uL该混个标谁落液于5mI.的容量瓶中，用乙睛十水（3.2.17)定容至刻度，摇句，即可获得伏马萨素13，浓度为101g/L、伏码毒素132浓度为5/mL的储裔液。
3.2.23伏马声素标推T.作溶液：分别取上述伏马素储备液（3.2.22）125μL、250L、500±1000μI.和2500l.置于5个5mL的容量瓶中，用乙腈十水(3.2.17)定容至刻度，获得5种不问浓度的伏马毒索工作标准游液。其中，伏马毒素B，标准工作溶液浓度为0.250ng/uL、0.500ng/μI.1.00ng/μl.、2.00ng/μL和5.00ng/μl.,伏马毒素B，标准工作溶液浓度为0.1251g/μL.0.250ng/μl.、0,500ng/μl.,1.00ng/μL利2.50ng/μl.3.3仪器和设备
3. 3. 1 天平:感量 0. 1 mg
3.3.2谷物粉碎机。
3.3.3离心管：塑料250mL，惜盖。3.3.4离心机：离心力不小于2500g。3.3.5滤纸.@l2cm Whatnan4号”，或相当者。3.3.6玻璃微纤维滤纸；d9cmWhatmanCF/A，或相当者。3.3.7免校亲和：对伏马毒素B和B均有100%的交义反应性。对伏马毒素B和B2总吸附容量大于5μg对于中醇-PBS溶液中含有1g伏马毒素的回收率≥90%。3.3.8玻璃注射器：10mL，目以与亲和柱相连。3.3.9微量注射器，25μl~1000μL。3.3. 10
空气压力泵可以与免疫亲和柱相连。3. 3. 11
高效液相色谱仪：配备20I.进样系统、荧光检测器和数据处现系统。氮吹仪。
滤膜：0.45um孔径，25mt直径的聚砜膜或当者。3.3.14振荡器。
3.4操作步骤
3.4.1提取
将样品用谷物粉碎机磨细至粒径小于1mm（全部通过1mm孔径的试验筛），称取20g（m，精确到1）Whatman1号为适合的市售产品的实例。给出这信息是为了方便本标推的使所者，并不表示本标准对该产品的认可。如果其他产品具有相同的效果，可经实验评估后使用这些等效的产品，下同。2
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0.1g）粉碎试样，置于250mL的离心管（3.3.3）中，加50ml提取液（3.2.16）。盖好离心管的盖，在振荡器（3.3.14）.水平振荡20min。在离心力为2500g条件下离心10tnin，用滤纸（3.3.5）过滤［清液（尽可能滤尽并避免将固体残留物转移到滤纸上，下同）；在离心管的残渣中再加50mI.提取液，以上述方式提取离心后，仍用1次的滤纸过滤，合并两次滤液。混合均勾后，量取10ml.滤液置于100mL的烧杯中，加10ml.PBS缓冲液（3.2.18），混匀。用玻璃微纤维滤纸（3.3.6)过滤，取10mL滤液用于免疫亲和柱(3.3.7)净化。
3、4.2免疫亲和柱净化
将免疫亲和柱（3.3.7)与玻璃注射器（3.3.8)下端连接。雅确移取10.0mLF:述滤液（3.4.1)加人玻璃注射器中，将空气压力泵（3.3.10）与玻璃注射器上端连接，加压，使滤液以1滴/s2滴/s的流速通过亲和柱，弃掉流出液。用1:述方式，再以10mLPBS缓冲液（3.2.18）清洗亲和柱，直至液体完全流出，空气通过，弃掉全部流出液。最后以1.5m1.甲醇（3.2.1)将亲和柱中的伏马毒素洗脱，控制流速为1滴/s，收集全部洗脱液了玻璃试管中，在60℃下用氮吹仪（3.3.12）以氮气吹·F，残留物置于4℃下存放，备用。测定前用乙睛·+水（3.2.17)400μL溶解残留物，此为供高效液相色谐测定用详品净化液。注，由于不同厂商提供的亲和住操作程序可能有所不同，实际操作时，请参照免疫亲和在产商提供的操作说明和程序使用。
3.4.3衍生化反应
分别取上述净化液（3.4.2)和标准工作溶液（3.2.23)各50μl.，分别置于1mL的各个试管中，各加人50μLOPA衍尘液（3.2.20），涡流混介器上混合30s，静置3mit后，立即取20uL衍生液进高效液相色谱仪分析。
3.4.4色谱参考条件
色谱柱：C柱或相当的柱，柱长150mm，内径4.6nm，填料直径5μm。流动相：见3.2.19。
流速:1. 0 mI./min。
荧光检测器：激发波长335nm、发射波长440nm。柱温室温。
3.4.5标准曲线制作
在上述色谱条件下，等基线平稳后制作标准曲线，优马毒素B和B，标准品的参考色谱图参见附录A。
分别吸取各标推溶的衍生液（3.4.3)20uL进样分析，以各衔生液衔生前的伏马毒素Bi，伏马书素B的色谱峰峰面积对相应标准I作溶液的浓度作图，制作伏马毒素BI、伏马毒素B的标准曲线。3.4.6测定
在上述色谱条件下，等基线平稳后进样分析。吸取20μL样液的衔生液（3.4.3)进样分析，比较样品与标准的色谱图，根据保留时间定性，根据伏马毒素3或132的峰面积查标准曲线，得到净化液中柑应的伏马毒素3,或13的浓度（)。如果伏马毒素的浓度超过了所制作的标准曲线浓度范围,用乙睛十水（3.2.17)将净化液稀释，筛后，重新进行衍牛化反应和色谱分析。3.4.7空白试验
除不加试样外，按3.4. 1至3.4.6的步骤逊行。3.5结果计算
3.5.1样品中伏马毒素B,或B的含量按式(1)计算：X =(c-G)XVX50X/
mx1000
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武中：
X1—-样品中伏马毒素B,或I3z的含量，单位为毫克每T克（mg/kg）;净化液中伏马毒素Bl或B的浓度，单位为纳克每微升(ng/μl.)：ce
空白试验的净化液中伏马毒素B，或Bz的浓度,单位为纳克每微升(ng/μrl)；净化液体积（400μL）,单位为微升（μL)；样品量与净化液对应样品量的倍数；-试样的质量，单位为克（g)；
于一一样品净化液的稀释倍数。3.5.2每个试样迹行两平行试验，两次测定重复性符合3.6,2要求，取两次测定的算术平均值作为测定结果。
3.6精密度
3.6.1实验室间试验
附录统计了本法精密度的实验室间测战数据。这些结果适用于给定的分析度范国和基体之内的样品。
3.6.2重复性
在同一实验室，出同一操作者使用相同设备，按相同的测试方法，并在短时间内对同-被测对象相独立进行测试，获得的两次独立测试结果的绝对差值大于按式（2)计算的重复性限（r)值的情况不超过5%。
伏马毒素 B 或 B.含量在 0~5 mg/kg 时： -- 0. 311 9 X F - 0. 026 2
重复性限；
F——两次测定结果的算术平均值，单位为毫克每下-克（mg/kg）3.6.3再现性
在不间的实验室，由不同的操作者使用不间的设备，按相同的测试方法，对同-被测对象相互独立进行測试，获得的两次独立测试结果的绝对差值大于按式(3)计算的再现性限(R)值的情况不超过5%，伏马毒素 Bl或 Bz含量在 0 ~5 mg/kg时：R =0. 405 3 X F - 0. 037 7
式中：
R——再现性限;
F—-两次测定结果的算术-均值，单位为毫克每千克（g/kg）。4免疫亲和柱层析净化荧光光度法4.1原理
....(3)
利用免疫亲和反应净化样品，样品净化后经邻苯二甲醛衍生化，用荧光光度计测定伏马毒素总量。4.2试剂和材料
除另有规定外所用试剂均为分析纯，实验用水应符合（GB/T6682中二级用水要求。4.2.1甲醇：色谱级。
4.2.2氯化钠。
4.2.3磷酸氢二钠。
4.2.4磷酸氮钾。
4.2.5氯化钾。
聚乙二醇(PFG8000)，
全品伙伴
4.2.7趾温-20(Twccn 20)。
4.2.8邻苯二甲醛(OPA)。
4. 2. 9 2-硫基乙醇(MCE)。
4.2.10四硼酸钠(NazB.0,10H20)。4, 2. 11
硫酸奎宇(CHNOS)。
4.2.12浓盐酸。
2nol/L盐酸溶液：将1体积浓盐酸（4.2.12)溶解在5倍体积水中。4.2.132
4.2.14浓硫酸。
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4.2.150.05mol/L硫酸溶液：取2.8mL浓硫酸（4.2.14），缓慢加人适量水中，冷却后定容至1 000 ml.。
醇+水－80→20。
4.2. 17 0,12 mol/L 四硼酸钠溶液:称取 4,6 g四硼酸钠(4.2. 10),用水溶解并定容至 100 ml。4. 2. 18 磷酸盐缓冲液(PBS):将 8. 0 g NaCI(4. 2. 2)、1. 2 g Na, HPO, (1. 2. 3)、0. 2 g KH,PO4(4. 2. 4)、0.2 gKCl(4. 2. 5)溶解于990 ml.水中,用2 mo1/L盐酸溶液(4.2. 13)调节 pH为 7. 0,最后定容为1
4.2.19清洗缓冲液：称取25gPEG8000(4.2.6），加1mL吡温-20（4.2.7），用磷酸盐缓冲液（4.2.18）溶解并稀释至1000mL，
4,2. 20 0PA衔生液:将 50 mg OPA(4. 2, 8)溶解在 1 mL 甲醇(4.2. 1)中,用 49 ml. 0.12 mol/L 四硼酸钠溶液（4.2.17)稀释。加2-硫基乙醇（MCE)（4.2.9)200μL，混勾，装丁密封的棕色瓶中，在室温避光处可以储藏1周。
4.2.21伏马毒素B,、Bz、B，标准品（fumonisins)：晶体，纯度>95%。4.2.226μ名/mL和12μg/mL总伏马毒素甲醇标准溶液：以伏马毒素Bl.B,,B标准品（4.2.21),按伏马毒素 B 、B, 和 B,的比例为 FB, 十FB,十FB,=5+2-+-1,配制 6 μg/mL 和 12 μg/ mL 总伏马毒素甲醇标雅液。
4.2.23荧光光度计标定溶液：称取一定量硫酸奎宁(4.2.11),用0.05mol/L硫酸溶液（4.2.15)稀释至100 ml.,用 6. 0μg/ml.和12μg/mL总伏马毒素甲醇标准溶液(4.2.22)各1mL,分别与等体积0PA衍牛液（4.2.20）涡流混合器上混合30s，静置3min，进行衍生化反应。炭光光度计激发波长335hm发射波长440nm的条件下，分别用0.05mol/1.硫酸溶液调节硫酸奎宁溶液的浓度，使两个硫酸奎宁溶液的炎光强度分别与6.0 ug/mL和12ug/mL总伏马毒素中醇标准溶液衍生液的荧光强度相等（配制时可参考：1μg/ml.硫酸奎宁的荧光强度约相当于1.5g/mLOPA-伏马毒索衍生液的荧光强度，具体根据实际情说定）。此标定液浓度一经确定，可在该获光光度计上多次使用4.3仪器和设备
4.3.1免疫亲和柱：同3.3.7。
4.3.2无荧光玻璃测试算。
4.3.3微纤维滤纸：11cm.孔径1.0pm4.3.4带不锈钢均质杯的高速均质器：转速约220001/min，4.3.51mL微量移液器和吸头。
4.3.620ml.微量移液器和吸头。4.4操作步骤
4.4.1提取
粉碎样品并使其全部通过 1 mm孔径的试验筛,称取粉碎后的试样50g(精确到0.1g)和5g氯化钠（4.2.2）置于均质杯中，人100mL甲醇十水溶液（4.2.16），益上均质杯的盖子，用高速均质器（4.3.4)均质1min。取下益子，将提取物倒人折叠式滤纸，滤液收集于1净的容器中。移取10.0mInt
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滤液，置于50ml.容量瓶中，用清洗缓冲被（4.2.19)稀释并定容至刻度。稀释液通过1.0μm微纤维滤纸(4.3.3)过滤，备用。
4.4.2免疫亲和柱净化
准确量取10tnL上述过滤、稀释的提取液（4.4.1),按 3.4.2相同的方法，使提取液全部通过伏马萨素免疫亲和样，百至空气逃人到亲和样中。再以上述法分别依次用10mL清洗缓冲液（4.2.19)和10 ml. PIS缓冲液(4.2.18)清洗免疫亲和柱,直至空气进人柱中。用甲醇(1. 2.1)1. U m1.(V\)以1滴/s的流速淋洗亲和柱，全部收集净化液于玻璃测试管中（4.3.2），备测，4.4.3荧光光度计标定
在激发波长335nm，发射波长440m条件下，以0.05mul/L硫酸溶液（4.2.15)为空白，调节炎光光度计的读数值为0.0。用荧光光度计标定溶液（4.2.23)调节荧光光度计的读数值为相当的伏马毒素浓度,即为 6 和 12。
4.4.4衍生与测定
于装有 1 tmL净化液(4.4.2)的玻璃试管中加人 1 mL OPA衍生被(4.2.20),混勾：将测试管置于已标定好的荧光光度计中，240s后读数，即为试样中伏马素浓度（c）。如超山荧光光度计读数12太多，需要将净化液稀释倍后重新测定。4.4.5空白试验
除不加试样外，按 4.4.1至 4.4.4 的步骤进行。4.5结果计算
4.5.1样品伏马毒素的含量按式（4)计算：X2 (c-c)×V\× 50 ×/
式中：
X：一-样品中伏马毒素的含量，单位为毫克每于克（mg/kg)；试样中伏马毒素的浓度，单位为微克每亳升（ug/ml.）)；Ca
空白试验中的伏马毒素浓度，单位为微克毫升（μg/ml)：V——-净化液体积（1mL）,单位为毫升（mL）；50
样品量与净化液对应样品量的倍数；试样的质员，单位为克（g）；
于一—样品净化液的稀释倍数。4.5.2每个试样进行两次乎行试验，两次测定重复性符合4.6.2要求，取两次测定的算术平均值作为测定结果。
4.6精密度
4.6.1实验室间试验
附录C统计了本方法精密度的实验室间测试数据。这些结果适用于给定的分析浓度范围和基体之内的样品。
4.6.2重复性
在同·实验室，出同一操作者使用相同设备，按相间的测试方法，并在短时间内对同-被测对象相H独立进行测试获得的两次独立测试结果的绝对差值人于按式（5）计算的重复性限（r）值的情况不超过5%。
总伏再毒素含量在 0～8 tng/kg 附：r = 0. 332 4 X F + 0. 221 6
T-—-重复性限；
两次测定结果的算术平均值，单位为毫克每千克（ng/kg），4.6.3再现性
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在不同的实验室，出不同的操作者使用不同的设备，按相同的测试方法，对问·被测对象相五独立进行测试状得的两次独立测试结采的绝对差值大于按式(6)计算的再现性限（R)值的情况不超过5%。总伏马毒素含量在u8mg/kg时：
R0.3324XF+0.2216
式中：
R——再现性限；
两次测定结果的算术平均值，单位为毫克每千克（mg/kg）。http：//
nate.net.
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（资料性附录）
伏马毒素 B,和 B，标准品的参考色谱图EwwW.bzxz.Net
伏马毒素 B,和 Bz标准品的参考色谱图全品伙伴网httn：//wwur
atenet
附录B
（资料性附录）
免疫亲和层析净化高效液相色谱法联合实验室测试结果GB/T 25228-2010
免疫亲和层析净化高效液相色谱法的实验室间测试统计结果见表B.1,样品为添加了伏马萨素标谁品（FB,+FB)的玉米和玉米制品。表B. 1
参加实验室的数盘
样品的数
去除离群值后的测
试实验室数革
所有可接受结果的
平均值/(mg/kg）
重复性的标准偏
差$+/(mg/kg)
重复性的变异
系数/%
重复性限值，T
(nig/kg)
再现性标推偏差，
sr/(mg/kg)
再现性的变异
系数/%
再现性限值，R
回收率/%
0.1960.784
联合实验室测试结果
玉米制品
0.204 : 0. 855
0. 049 2/0. 032 4:0. 043 6 0. 047 6 0, 458 1 0. 190 40. 044 00. 029 2:0. 056 0j0. 033 70, 502 20. 205 412. 2
0.0830.1580.095
0.049 30. 032 40.044 20.055 40. 628 30.190 40,053 30.035 10.128 0;0. 033 70. 609 5/0.322 612.2
合品伙伴网httn
CB/T25228—2010
附录C
（资料性附录）
免疫亲和柱层析净化荧光光度法联合实验室测试结果免疫亲和柱层析净化荧光光度法的实验室间测试统计结果见表C.1，样品为添加了伏马毒素标推品FBs(FB3:+FB2+F3.5+2+1)的_F米和米制品。表 C.1联合实验室测试结果
参加实验案的数量
样品的数虽
去除离群值后的测试实验案数革所有可接受结果的数斑
平均值/（tng/kg）
重复性的标准偏差，5,/(mg/kg）重复性的变异系数/%
重复性限值,r/(mg/kg)
再现性标准偏差，sx/（mg/kg）再现性的变异系数/%
再现性限值，R/（mg/kg）
回收率/%
http
//wwur
nate.net.
玉米制品
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