GB/T 25170-2010
基本信息
标准号： GB/T 25170-2010
中文名称：畜禽基因组BAC文库构建与保存技术规程
标准类别：国家标准(GB)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
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标准简介
GB/T 25170-2010 畜禽基因组BAC文库构建与保存技术规程
GB/T25170-2010
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标准内容
ICS 65. 020. 30
中华人民共和国国家标准
GB/T 25170--2010
畜禽基因组BAC文库构建与
保存技术规程
Technical regulation of farm animais genome BAC libraryconstrction and prescrvation2010-09-26发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
今口代网
2011-03-01实施
本标准由中华人民共和国农业部提出。前
本标准由全国畜收业标准化技术委员会（SAC/TC274)归口：本标起草单位：中国农业科学院北京畜牧曾医研究所。本标准主要起草人：关伟军、马月辉、刘长青、潘春留、刘洪坤、甫亚斌、余解露.:
食品化付
GB/T 25170—2010
畜禽基因组BAC文库构建与
保存技术规程
本标准规定了畜禽基因组BAC文库构建方法。GB/T 25170-2010
本标准适用于猪、牛、羊、马,驴、鸡,鸭等窗禽的基因组BAC文库构建与保存规范性引用文件，
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注期的引用义件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些义件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验空用水规格和试验方法术语和定义
下列术语和定义适用于本标推
基因组文库
genome library
用重组DNA技术将某种生物细胞的核DNA的全部片段随机地连接到载体.I:再转移至适当的宿主绷胞中，通过细胞增殖而形成的各个片段的无性繁殖系的总集。3.2
细菌人工染色体bacterialartificialchromosome，BAc以大肠杆菊致育因子为基础，利用现代重组DNA技术体外人工合成的具有容纳高分子最外源.1DNA的特性载体。.
DNA连接DNA ligation
在DNA连接酶催化下，靶DNA片段与载体I>NA相邻的5端磷酸与3'端羟基之问形成磷酸二酯键的过程。
competent rells
感爱态细胞
在特定条件下细胞膜通透性发生改变，允许外源DNA进人细胞内的特殊状态下的受休细胞。3.5
电转化clectrntransformation
在高压脉泌的作用下,将外源DNA导人感受态细胞的过程3.6
脉冲场凝胶电泳
pulse field gel electrophoresis,PFGE利用脉冲场电泳系统电场方向周期性交替变化的功能而分离和鉴定生物大分子的技术3.7
重组体
recmbinant
两种以I:不同求源的DNA片段连接所形成的杂种DNA分了GB/T 25170—2010
试剂及溶液配制
除另有规延外,域剂为分析纯或生化试剂。实验用水要符合 GB/T:6682 巾·级水的要求4.1LB培养冻存缓冲液(luria-hcrtani mcdia) 360 mmol/I. K,HPO4,13, 2 mino1/I. KH,PO;,1. 7 mmol/L 柠檬酸钠,0. 4 mmol/1 MgSO6.8 mmol/L(NH,),SO,,4. 4%甘油,定容至 100 mL,应用时以冻存缓冲液与 IB液体培养基 1 :g 的比例配制。bZxz.net
4. 25-澳-4-氯-3-吲哚-μ--半乳糖苷贮存液(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactosidle,X-gal)用二甲基甲酰胺溶解 X-gal,配成 20 mg/mL贮存液，一20 ℃避光保存。4.3 : 1 mol/L Tris-CI
12t.10g/1，Tris碱溶于800mL/L双蒸水（daubledistilledH,O，ddH:0)中，用HCI调pH至8.0,定容至 1 000 mL,高压灭菌。4.4内切酶缓冲液
10 mg/mL BSA,10×酶反应缓冲液,1 mmol/L DTT,1 mmol/L 亚精胺：4. 5 SOC 培养基
称取20.00g胰化蛋自陈，5.00g酵母提取物0.50gNaCl，量取2.5mL1mol/LKCi,10mL2 mol/L MgSO, 或 MgCl.,溶于980 mL ddH,O,高压灭菌庐冷却至 60 ℃C以下,加人 10 mL 2 mol/L葡萄糖液。
4.6异丙基硫代-p-D-半乳糖苷溶液（isopropylthio-p-D-galactoside，IPTC)称取 1. 00 g 1PTG 溶于 5. 0 mL 双蒸水中,过滤除菌装成 1 mL/份,贮存于一20 C4.7琼脂糖块储存液
800 mL ddH,O 中加人 186. 10 g 乙二胺四乙酸二钠(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA),在磁力搅拆器上搅拌，调pH至8.0，加ddH.0定容至1000mL，高压灭菌。4.8CsCI 密度梯度离心纯化液
3.3mL饱和 CsCl,加灭菌石蜡油至总体积10 mL4.9十二烷基肌氨酸钠缓冲液（N-Dodecanoyl-N-methylglycinesodiumsalt，NDS）称取 186. 00 多 EDTA 和 1. 20 g Tris-Cl,溶于 700 mL ddH,O 中,调 pII 室 8, 0,加人 NDS 调 pH至 9. 5,用 ddH,0 定容至 1 L,过滤灭菌。4.10抗凝剂(柠檬酸钠葡萄糖液）称取:0. 48 g柠檬酸、1. 32 g柠檬酸钠,1. 47 g葡萄糖:用 ddII,0定容至 100. mL-,高压灭菌。4.11氯霉素
乙醇配制,工作浓度为12.5 μg/ml，一20℃保存。4,12Tris(10mmol/LpH8.0)-EDTA(1.0mmol/1.pH8.0)缓冲液,TE10mmol/LpH8.0Tris-Cl,1.0mmol/I.pH8.0FDTA，高压灭菌，室温保存。4,13LB 液体培养基
称取 10. 00 g细菌培养用胰蛋白陈、5. 0) g 细菌培养用醛母提取物,10, 00 多 NμCI.溶于 800 m1.dd,中,调 pH至 7.4,定容至 1 L高压炙菌。4.14 LB 固体培养基
称玻10.00 g细菌培养用膜蛋白陈,5.00 g细菌培养用酵母提取物、10.00 NaC),溶于:800 tnI.ddHI.O 中,调 pII 至 7. 4,加入 15.00 名绷胞培养用琼脂,定容至 1 L,高压灭菌。4.15含特定抗生素培养基
按照4.14的方法配制好LB固休培养基，高压灭菌后待其不烫手时，按2mL培养基：1pL氯需素(12. μg/mL)的比例添加氯霉素,倒 20 mL培养基于 90 mm 培养板中。待培养基凝固后,将 40 μL2
X-gel和7I。IPTG混匀后，均匀涂于培养基表面，超净台里晾十备用。4.:16碱裂解液I
GB/T 25170—2010
50ntnoal/1.谢药糖，25mmol/LpH8.0Tris-Cl,10mmol/LpH8.0EDTA,定容1L，高压灭菌，4℃保存。
4. 17：碱发解液Ⅱ
0.2mol/LNa0H,1%SDS，现用现配。4.18·碱裂解液Ⅱ
1.32tmo1/L乙酸甲，4℃保存。
主要仪器、设备
水济锅、电热恒温鼓风干爆箱、培养箱，子天平，自动成像分析系统和脉冲电泳仪等。6
基因组 BAC 文库构建
6.1高分子量DNA制备
6.1.1细胞收集
6.1.1.1家禽血细胞的收集
-80 C低温冰箱、超纯水仪、低温离心机、凝胶采集3.0mL~5.0ml.葡食新鲜iL液，文即注入含1mL肝素钠(500U/mL)或柠檬酸钠葡萄糖的离心管中抗凝，4下，4500g离心5uin，齐上清，加人等体积预冷的pH7.0磷酸盐缓冲液(phosphate buffcied salite,PRS)混匀。1述血细胞收集步骤重复离心3次后,加l入 1.0 mL PBS重悬细胞。重悬细瓶后计数,将血细胞密度稀释到1.0×10°个/mL～2.5×10*个/mL。6.1.1.2家畜血细胞的收集
采集10mL~20mL家育新鲜血液，加人等体积红细贮裂解液，37℃下放置1h，4℃下，583g离心5min,其余步骤同6.1.1.1。
6.1.1.3畜禽其他组织细胞收集
在于球或液氮存在的条件下，将新鲜的畜窝组织碾成粉未，悬浮在PBS中，振荡混勾，用两层纱布过滤。其余步骤同6.1.1,1。
6. 1.2细胞裂解
取细胞密度为1.0×10个/mL～2.5×10*个/mL的液和1%低熔点琼脂糖在45℃下放置5min后,等体积混勾,隔 3 nuin～5 tin 再混勾-.次。将 100 uL 混合液置于专用模其中,4 ℃ 下效置 15 min~-30 min 形成凝胶块。将凝胶块置于含有 0. 1 mg/mL 蛋白酶 K 和 30 mL 1% NDS缓冲液中,50 ℃下水浴3后更换相同缓冲液，再50℃水浴24h~28h。用30mLTE缓冲液（pH7.6）在30min内洗涤3次（冰上操作）以去除TF缓冲液，置于1.0nmoi/L苯甲基磺献氟（phenylmethylsulfonylfluoride，PMsF)中，50℃下水浴30min，中问换液一次。将凝胶块储存于0.5mol/LEDTA（pH8.0)中4C可保存半年。6. 1. 3 ~基因组 DN4 酶切与回收将凝胶块在4℃下用30mLTE缓冲液浸泡3h～1h，中间换液3次~4次。置于1ml.的适宜限制性内切酶缓冲液中，冰浴1h，中闻换液1次。分别移至不同酶量(1U～20U)的海切级冲液中，冰上渗透1h后，37℃下酶切10min～30min，用1/10体积0.5mol/LEDTA（pH8.0）终止反应。将不完全消化的TNA凝胶块在0.5×TBE中,13℃,180V～~120V,120角，脉神时间60s～10s条件下逊行PFGE电泳，电泳时间16h~24h。
6.1.4·最适BNA片段获得
6.1.4.1第一次电泳选择
用1%琼脂糖凝胶电泳分离酶切获得的大分了量DNA，电泳条件同6.1.3，电泳时间24h。电泳缩3
GB/T 25170—2010
束后,取出凝胶将 DNA分子量标尺与相邻胶切下,在 0.5×TBE 中染色.40 min 后。置于长波紫外灯下观察，用标尺测量并标记凝胶块所需回收的分子量的片段（100kb～400kb）6.1,4.2第二次电泳选择
将未染色的样品条带切成100kb~200kb.200kb~300kb和300kb~400kb.=段，用新的1%琼脂糖凝胶进行第二次脉冲泳，电泳条件向第一次电泳选择条件。根据DNA分子最标尺切下各条带中100kb～400kb的DNA片段，用TE洗2次～3次保存在0.5mol/L,EDTA中。6.1. 5电洗脱
6.1.5.1．透析袋处理
透析袋在2%（质量浓度）NaHCO和1mmol/LEDTA（pH8.0)溶液中煮沸10min，用蒸馏水御底漂洗,再置于 1 mmol/L EDTA(pII8. 0)中煮沸 10 min后冷却,4 ℃下保存于纯水中。6.1.5.2电泳
将不同大小范围 DNA胶条分别放入一透析袋中,用 0.5X TBE充满透析袋,浸池在 0. 5×,TBE-的电泳槽中，13℃，120°角，4V/cm~5V/cm电泳3h，使DNA分子从凝胶中移出。将透析袋旋转180°再电泳30 g~1 min，以解析透析袭上:的DNA分子。6.1.5.3．电泳后处理
电泳结束后将透析袋在4℃下0.5×TE中透析12h，从透析袋中将回收的DNA溶液吸出，依照一定的分子置标尺对回收的基因组 DNA进行定量。保存于 4 ;一周内使用。6.2BAC质粒裁体制备
.6.2.1BAC载体制备
.SDS碱裂解法制备BAC裁体。将含有适当BAC质粒的菌液涂布于含12.5i/mL.的氯霉素的LB平板上，37℃培养12h。挑单个菌落接种到LB液体培养液中，200r/min，37.℃振荡过夜。将6mL培养物，4℃下，20000g离心1min，收渠细菌。细菌沉淀悬浮于碱裂解液1中，剧烈振葛：加新：配制的碱裂解液Ⅱ于细菌悬液中，颠倒滤勾，放置于冰上。加碱裂解腋Ⅱ，颠倒匀。1℃下，20000g离心 30 min,取上清,加入 0.6 倍体积的异丙醇,混,室温放置 10 min。4℃ 下,20 000g离心30 min;回收核酸沉淀，用70%的乙醇涮洗管底及管壁，室温T燥DNA沉淀。用TE（pH8.0）溶解核酸沉淀。6.2.2超螺旋质粒纯化
密度梯度离心法纯化超螺旋质粒。每毫升DNA样品加1.00g固体CsCI,至完全溶解。加入DNA和 CsCl1 溶液,混匀,加石蜡池,800 0(0g 离心 24 h 后,可见两条相隔约 4 initn 的清晰条带,弃石蜡油和部分溶液，吸取线坏式质粒和超螺旋质粒于-离心管中。收集液体于透析袭中，依饮用2.0L0.5×TE：透析3h,4I0.5XTE透析4h，4L0.5XTE透析12h。收集液体，4℃保存。6.2.3BAC载体酶切和去磷酸化
用适当的限制性内切酶进行酶切，反应体系为20μl,10×缓冲液;100.uL(5μg～10μg）载体DNA;1uL40mmol/I.业精胺，适当的限制性内切酶；用ddH，D定容至150μL，37.℃下酶切6h后，加人 2. 0 μL 1 U/μl,牛小肠碱性磷酸酶(calf intestinal alkaline phosphatase,CIAP)和 20 μL 10.XCIAP缓冲液，用dldH.0定容至190μL,37℃放置1h后，70℃反应15min，逊行去磷酸化。通过低熔点琼脂糖凝胶电泳分离载休DNA，染色，紫外灯显示条带，经熔化凝胶和臀三氧甲烷抽提进行载体DNA的回收。
6.2.4载体脱磷效果检测
分别用 T4 I3NA连接酶利I T4 DNA 连接酶缓冲液及 T4多核苷酸激酶对所制备的载体于 16 ℃自连 12 h。取 1.5 μL～2,0μL连接产物加到 18 μuL～20 μL适当的感受态细胞中,37℃ 下,在 SOC培养基中,200 r/min 下培养 1 h。将转化的荫液适量涂布于含有氯霉紊,IPTG 和 X-gal 的 I,B 固体养基表面，下37℃下放置24 h～36h，检测脱磷效率。合品伙伴网
6.2.5载体连接率检测
GB/T 251702010
16℃下，将制备的裁体与经酶切的入DNA在T4DNA连接酶的作用下连接12h。反应体系为1.0μLT4DNA连接酶;10μL2倍连接缓冲液;10μL（约25ng)载体DNA;2.EμL(约100ng）100kb标准外源片段。把灭活后的连接产物加到适当的感受态细胞中，经培养后取适量菌液涂布于含氧霉素、IPTG和X-gal的LB固体培养基表面，37℃下，培养24h~36h。随机挑取若干个白色菌落于3nLLB液体培养基中培养12H。提取少量质拉DNA，经酶切后进行脉冲电泳检测，电泳条件同酶切国收，电泳时间24h。脉冲结策后，经染色，检测外源片段插人情况，6.3感爱态细胞制备
取一80℃冰箱中保存的适当的菌种复苏，培养至光密度值(opticel derisity，ODso）药为0.72～0.76后，置于冰水混合物中骤冷，4℃下1000g离心10min，弃上清，用ddH，0重感菌休，4℃下1000g离心10min，弃上清。加10%日油重悬，4℃1000g离心10min，重复2次，弃上清，用残存管底的甘油悬浮细胞，4℃下1000g离心2min弃上清，用1.0mL10%甘油重忌细胞以每管100L分装于离心臂中，一80.℃保存。
6.4·基因组 JNA和戴体 DNA的连接将向收的大片段DNA与30ng制备好的载体以112～1：3的比率连接，连接体系含400U的T4DNA连接，16℃下连接12h。65℃漏育15min，将连接产物转移到0.025um的透析膜中央，用0.5×TE4℃透析2h。从透析膜上回收透析产物，再用0.5×TF+30%的PEC80004℃透析30 min,浓缩连接合物中的DNA。6.5电转化
将适当的感受态绷胞置于冰上解冻后，取20μL感受态细胞，加人2.0μL重组体连接物，冰上放置1min-~5min。特混舍液加人预冷的电击杯中，电步。取出电转化后的细胞移至1mI37℃的S0C培养基中，混匀，37℃下225r/min培养1h～1.5h。销于含有氯霉素、1PTG和X-gal的固体LB培养基表面，37℃倒置培养24h。随机挑选白斑，用酶切鉴定插入大小，片段大小应在100kb以上，转化次数在50次左右，可以进行大量连接和转化。转化后的菌液用含10火甘油的LB冻存液，以每份500L分装，于一80 ℃保存。
甚因组BAC文库的保存
琅山转化的冻存菌液，于冰上融化。取适量渐液涂于氯宪素板上，37℃培养 24 h，将 I.13培养冻存液以每孔110u，加到384孔培养板中。将氯素平板上的白色菌落挑至384孔板，每孔1个菌落将384孔板置于专用摇床中，37℃下培养24h。取出384孔板进行编号，即为文库舟板，将文库册板置于一80 ℃冰箱中长期保存。
8文库的扩增及应用
应用白动乎板复制器将已构建好的文库母本复谢若平份，复制完成后将384孔板置于专用摇床中37℃下培养24h，一80℃保存工作文库，逊行后续相关研究。5
GB/T 25170-2010
打印片期：2010年12月6F001
合品伙伴用
中华人民共和国
国家标准
畜禽基因组BAC文库构建与
保存技术规程
GB/T25170.--2010
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电话：68523946：68517578
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开本 880×12301/16印张 0.75字数 11字2010年11月第版，2010年11月第一次印刷*
书号：155066，1-40632
定价：16.00元
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举报电话：(010)68533533
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本标准规定了畜禽基因组BAC文库构建方法。GB/T 25170-2010
本标准适用于猪、牛、羊、马,驴、鸡,鸭等窗禽的基因组BAC文库构建与保存规范性引用文件，
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注期的引用义件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些义件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验空用水规格和试验方法术语和定义
下列术语和定义适用于本标推
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用重组DNA技术将某种生物细胞的核DNA的全部片段随机地连接到载体.I:再转移至适当的宿主绷胞中，通过细胞增殖而形成的各个片段的无性繁殖系的总集。3.2
细菌人工染色体bacterialartificialchromosome，BAc以大肠杆菊致育因子为基础，利用现代重组DNA技术体外人工合成的具有容纳高分子最外源.1DNA的特性载体。.
DNA连接DNA ligation
在DNA连接酶催化下，靶DNA片段与载体I>NA相邻的5端磷酸与3'端羟基之问形成磷酸二酯键的过程。
competent rells
感爱态细胞
在特定条件下细胞膜通透性发生改变，允许外源DNA进人细胞内的特殊状态下的受休细胞。3.5
电转化clectrntransformation
在高压脉泌的作用下,将外源DNA导人感受态细胞的过程3.6
脉冲场凝胶电泳
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重组体
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试剂及溶液配制
除另有规延外,域剂为分析纯或生化试剂。实验用水要符合 GB/T:6682 巾·级水的要求4.1LB培养冻存缓冲液(luria-hcrtani mcdia) 360 mmol/I. K,HPO4,13, 2 mino1/I. KH,PO;,1. 7 mmol/L 柠檬酸钠,0. 4 mmol/1 MgSO6.8 mmol/L(NH,),SO,,4. 4%甘油,定容至 100 mL,应用时以冻存缓冲液与 IB液体培养基 1 :g 的比例配制。bZxz.net
4. 25-澳-4-氯-3-吲哚-μ--半乳糖苷贮存液(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactosidle,X-gal)用二甲基甲酰胺溶解 X-gal,配成 20 mg/mL贮存液，一20 ℃避光保存。4.3 : 1 mol/L Tris-CI
12t.10g/1，Tris碱溶于800mL/L双蒸水（daubledistilledH,O，ddH:0)中，用HCI调pH至8.0,定容至 1 000 mL,高压灭菌。4.4内切酶缓冲液
10 mg/mL BSA,10×酶反应缓冲液,1 mmol/L DTT,1 mmol/L 亚精胺：4. 5 SOC 培养基
称取20.00g胰化蛋自陈，5.00g酵母提取物0.50gNaCl，量取2.5mL1mol/LKCi,10mL2 mol/L MgSO, 或 MgCl.,溶于980 mL ddH,O,高压灭菌庐冷却至 60 ℃C以下,加人 10 mL 2 mol/L葡萄糖液。
4.6异丙基硫代-p-D-半乳糖苷溶液（isopropylthio-p-D-galactoside，IPTC)称取 1. 00 g 1PTG 溶于 5. 0 mL 双蒸水中,过滤除菌装成 1 mL/份,贮存于一20 C4.7琼脂糖块储存液
800 mL ddH,O 中加人 186. 10 g 乙二胺四乙酸二钠(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA),在磁力搅拆器上搅拌，调pH至8.0，加ddH.0定容至1000mL，高压灭菌。4.8CsCI 密度梯度离心纯化液
3.3mL饱和 CsCl,加灭菌石蜡油至总体积10 mL4.9十二烷基肌氨酸钠缓冲液（N-Dodecanoyl-N-methylglycinesodiumsalt，NDS）称取 186. 00 多 EDTA 和 1. 20 g Tris-Cl,溶于 700 mL ddH,O 中,调 pII 室 8, 0,加人 NDS 调 pH至 9. 5,用 ddH,0 定容至 1 L,过滤灭菌。4.10抗凝剂(柠檬酸钠葡萄糖液）称取:0. 48 g柠檬酸、1. 32 g柠檬酸钠,1. 47 g葡萄糖:用 ddII,0定容至 100. mL-,高压灭菌。4.11氯霉素
乙醇配制,工作浓度为12.5 μg/ml，一20℃保存。4,12Tris(10mmol/LpH8.0)-EDTA(1.0mmol/1.pH8.0)缓冲液,TE10mmol/LpH8.0Tris-Cl,1.0mmol/I.pH8.0FDTA，高压灭菌，室温保存。4,13LB 液体培养基
称取 10. 00 g细菌培养用胰蛋白陈、5. 0) g 细菌培养用醛母提取物,10, 00 多 NμCI.溶于 800 m1.dd,中,调 pH至 7.4,定容至 1 L高压炙菌。4.14 LB 固体培养基
称玻10.00 g细菌培养用膜蛋白陈,5.00 g细菌培养用酵母提取物、10.00 NaC),溶于:800 tnI.ddHI.O 中,调 pII 至 7. 4,加入 15.00 名绷胞培养用琼脂,定容至 1 L,高压灭菌。4.15含特定抗生素培养基
按照4.14的方法配制好LB固休培养基，高压灭菌后待其不烫手时，按2mL培养基：1pL氯需素(12. μg/mL)的比例添加氯霉素,倒 20 mL培养基于 90 mm 培养板中。待培养基凝固后,将 40 μL2
X-gel和7I。IPTG混匀后，均匀涂于培养基表面，超净台里晾十备用。4.:16碱裂解液I
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50ntnoal/1.谢药糖，25mmol/LpH8.0Tris-Cl,10mmol/LpH8.0EDTA,定容1L，高压灭菌，4℃保存。
4. 17：碱发解液Ⅱ
0.2mol/LNa0H,1%SDS，现用现配。4.18·碱裂解液Ⅱ
1.32tmo1/L乙酸甲，4℃保存。
主要仪器、设备
水济锅、电热恒温鼓风干爆箱、培养箱，子天平，自动成像分析系统和脉冲电泳仪等。6
基因组 BAC 文库构建
6.1高分子量DNA制备
6.1.1细胞收集
6.1.1.1家禽血细胞的收集
-80 C低温冰箱、超纯水仪、低温离心机、凝胶采集3.0mL~5.0ml.葡食新鲜iL液，文即注入含1mL肝素钠(500U/mL)或柠檬酸钠葡萄糖的离心管中抗凝，4下，4500g离心5uin，齐上清，加人等体积预冷的pH7.0磷酸盐缓冲液(phosphate buffcied salite,PRS)混匀。1述血细胞收集步骤重复离心3次后,加l入 1.0 mL PBS重悬细胞。重悬细瓶后计数,将血细胞密度稀释到1.0×10°个/mL～2.5×10*个/mL。6.1.1.2家畜血细胞的收集
采集10mL~20mL家育新鲜血液，加人等体积红细贮裂解液，37℃下放置1h，4℃下，583g离心5min,其余步骤同6.1.1.1。
6.1.1.3畜禽其他组织细胞收集
在于球或液氮存在的条件下，将新鲜的畜窝组织碾成粉未，悬浮在PBS中，振荡混勾，用两层纱布过滤。其余步骤同6.1.1,1。
6. 1.2细胞裂解
取细胞密度为1.0×10个/mL～2.5×10*个/mL的液和1%低熔点琼脂糖在45℃下放置5min后,等体积混勾,隔 3 nuin～5 tin 再混勾-.次。将 100 uL 混合液置于专用模其中,4 ℃ 下效置 15 min~-30 min 形成凝胶块。将凝胶块置于含有 0. 1 mg/mL 蛋白酶 K 和 30 mL 1% NDS缓冲液中,50 ℃下水浴3后更换相同缓冲液，再50℃水浴24h~28h。用30mLTE缓冲液（pH7.6）在30min内洗涤3次（冰上操作）以去除TF缓冲液，置于1.0nmoi/L苯甲基磺献氟（phenylmethylsulfonylfluoride，PMsF)中，50℃下水浴30min，中问换液一次。将凝胶块储存于0.5mol/LEDTA（pH8.0)中4C可保存半年。6. 1. 3 ~基因组 DN4 酶切与回收将凝胶块在4℃下用30mLTE缓冲液浸泡3h～1h，中间换液3次~4次。置于1ml.的适宜限制性内切酶缓冲液中，冰浴1h，中闻换液1次。分别移至不同酶量(1U～20U)的海切级冲液中，冰上渗透1h后，37℃下酶切10min～30min，用1/10体积0.5mol/LEDTA（pH8.0）终止反应。将不完全消化的TNA凝胶块在0.5×TBE中,13℃,180V～~120V,120角，脉神时间60s～10s条件下逊行PFGE电泳，电泳时间16h~24h。
6.1.4·最适BNA片段获得
6.1.4.1第一次电泳选择
用1%琼脂糖凝胶电泳分离酶切获得的大分了量DNA，电泳条件同6.1.3，电泳时间24h。电泳缩3
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束后,取出凝胶将 DNA分子量标尺与相邻胶切下,在 0.5×TBE 中染色.40 min 后。置于长波紫外灯下观察，用标尺测量并标记凝胶块所需回收的分子量的片段（100kb～400kb）6.1,4.2第二次电泳选择
将未染色的样品条带切成100kb~200kb.200kb~300kb和300kb~400kb.=段，用新的1%琼脂糖凝胶进行第二次脉冲泳，电泳条件向第一次电泳选择条件。根据DNA分子最标尺切下各条带中100kb～400kb的DNA片段，用TE洗2次～3次保存在0.5mol/L,EDTA中。6.1. 5电洗脱
6.1.5.1．透析袋处理
透析袋在2%（质量浓度）NaHCO和1mmol/LEDTA（pH8.0)溶液中煮沸10min，用蒸馏水御底漂洗,再置于 1 mmol/L EDTA(pII8. 0)中煮沸 10 min后冷却,4 ℃下保存于纯水中。6.1.5.2电泳
将不同大小范围 DNA胶条分别放入一透析袋中,用 0.5X TBE充满透析袋,浸池在 0. 5×,TBE-的电泳槽中，13℃，120°角，4V/cm~5V/cm电泳3h，使DNA分子从凝胶中移出。将透析袋旋转180°再电泳30 g~1 min，以解析透析袭上:的DNA分子。6.1.5.3．电泳后处理
电泳结束后将透析袋在4℃下0.5×TE中透析12h，从透析袋中将回收的DNA溶液吸出，依照一定的分子置标尺对回收的基因组 DNA进行定量。保存于 4 ;一周内使用。6.2BAC质粒裁体制备
.6.2.1BAC载体制备
.SDS碱裂解法制备BAC裁体。将含有适当BAC质粒的菌液涂布于含12.5i/mL.的氯霉素的LB平板上，37℃培养12h。挑单个菌落接种到LB液体培养液中，200r/min，37.℃振荡过夜。将6mL培养物，4℃下，20000g离心1min，收渠细菌。细菌沉淀悬浮于碱裂解液1中，剧烈振葛：加新：配制的碱裂解液Ⅱ于细菌悬液中，颠倒滤勾，放置于冰上。加碱裂解腋Ⅱ，颠倒匀。1℃下，20000g离心 30 min,取上清,加入 0.6 倍体积的异丙醇,混,室温放置 10 min。4℃ 下,20 000g离心30 min;回收核酸沉淀，用70%的乙醇涮洗管底及管壁，室温T燥DNA沉淀。用TE（pH8.0）溶解核酸沉淀。6.2.2超螺旋质粒纯化
密度梯度离心法纯化超螺旋质粒。每毫升DNA样品加1.00g固体CsCI,至完全溶解。加入DNA和 CsCl1 溶液,混匀,加石蜡池,800 0(0g 离心 24 h 后,可见两条相隔约 4 initn 的清晰条带,弃石蜡油和部分溶液，吸取线坏式质粒和超螺旋质粒于-离心管中。收集液体于透析袭中，依饮用2.0L0.5×TE：透析3h,4I0.5XTE透析4h，4L0.5XTE透析12h。收集液体，4℃保存。6.2.3BAC载体酶切和去磷酸化
用适当的限制性内切酶进行酶切，反应体系为20μl,10×缓冲液;100.uL(5μg～10μg）载体DNA;1uL40mmol/I.业精胺，适当的限制性内切酶；用ddH，D定容至150μL，37.℃下酶切6h后，加人 2. 0 μL 1 U/μl,牛小肠碱性磷酸酶(calf intestinal alkaline phosphatase,CIAP)和 20 μL 10.XCIAP缓冲液，用dldH.0定容至190μL,37℃放置1h后，70℃反应15min，逊行去磷酸化。通过低熔点琼脂糖凝胶电泳分离载休DNA，染色，紫外灯显示条带，经熔化凝胶和臀三氧甲烷抽提进行载体DNA的回收。
6.2.4载体脱磷效果检测
分别用 T4 I3NA连接酶利I T4 DNA 连接酶缓冲液及 T4多核苷酸激酶对所制备的载体于 16 ℃自连 12 h。取 1.5 μL～2,0μL连接产物加到 18 μuL～20 μL适当的感受态细胞中,37℃ 下,在 SOC培养基中,200 r/min 下培养 1 h。将转化的荫液适量涂布于含有氯霉紊,IPTG 和 X-gal 的 I,B 固体养基表面，下37℃下放置24 h～36h，检测脱磷效率。合品伙伴网
6.2.5载体连接率检测
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16℃下，将制备的裁体与经酶切的入DNA在T4DNA连接酶的作用下连接12h。反应体系为1.0μLT4DNA连接酶;10μL2倍连接缓冲液;10μL（约25ng)载体DNA;2.EμL(约100ng）100kb标准外源片段。把灭活后的连接产物加到适当的感受态细胞中，经培养后取适量菌液涂布于含氧霉素、IPTG和X-gal的LB固体培养基表面，37℃下，培养24h~36h。随机挑取若干个白色菌落于3nLLB液体培养基中培养12H。提取少量质拉DNA，经酶切后进行脉冲电泳检测，电泳条件同酶切国收，电泳时间24h。脉冲结策后，经染色，检测外源片段插人情况，6.3感爱态细胞制备
取一80℃冰箱中保存的适当的菌种复苏，培养至光密度值(opticel derisity，ODso）药为0.72～0.76后，置于冰水混合物中骤冷，4℃下1000g离心10min，弃上清，用ddH，0重感菌休，4℃下1000g离心10min，弃上清。加10%日油重悬，4℃1000g离心10min，重复2次，弃上清，用残存管底的甘油悬浮细胞，4℃下1000g离心2min弃上清，用1.0mL10%甘油重忌细胞以每管100L分装于离心臂中，一80.℃保存。
6.4·基因组 JNA和戴体 DNA的连接将向收的大片段DNA与30ng制备好的载体以112～1：3的比率连接，连接体系含400U的T4DNA连接，16℃下连接12h。65℃漏育15min，将连接产物转移到0.025um的透析膜中央，用0.5×TE4℃透析2h。从透析膜上回收透析产物，再用0.5×TF+30%的PEC80004℃透析30 min,浓缩连接合物中的DNA。6.5电转化
将适当的感受态绷胞置于冰上解冻后，取20μL感受态细胞，加人2.0μL重组体连接物，冰上放置1min-~5min。特混舍液加人预冷的电击杯中，电步。取出电转化后的细胞移至1mI37℃的S0C培养基中，混匀，37℃下225r/min培养1h～1.5h。销于含有氯霉素、1PTG和X-gal的固体LB培养基表面，37℃倒置培养24h。随机挑选白斑，用酶切鉴定插入大小，片段大小应在100kb以上，转化次数在50次左右，可以进行大量连接和转化。转化后的菌液用含10火甘油的LB冻存液，以每份500L分装，于一80 ℃保存。
甚因组BAC文库的保存
琅山转化的冻存菌液，于冰上融化。取适量渐液涂于氯宪素板上，37℃培养 24 h，将 I.13培养冻存液以每孔110u，加到384孔培养板中。将氯素平板上的白色菌落挑至384孔板，每孔1个菌落将384孔板置于专用摇床中，37℃下培养24h。取出384孔板进行编号，即为文库舟板，将文库册板置于一80 ℃冰箱中长期保存。
8文库的扩增及应用
应用白动乎板复制器将已构建好的文库母本复谢若平份，复制完成后将384孔板置于专用摇床中37℃下培养24h，一80℃保存工作文库，逊行后续相关研究。5
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打印片期：2010年12月6F001
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国家标准
畜禽基因组BAC文库构建与
保存技术规程
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开本 880×12301/16印张 0.75字数 11字2010年11月第版，2010年11月第一次印刷*
书号：155066，1-40632
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