GB/T 25165-2010 明胶中牛、羊、猪源性成分的定性检测方法 实时荧光PCR法 GB/T25165-2010 标准下载解压密码：www.bzxz.net

ICS 65. 020. 30
中华人民共和国国家标准
GB/T25165—2010
明胶中牛、羊、猪源性成分的定性检测方法实时荧光PCR法
Protocol of identification of bovine,caprine,ovine and porcine derivedmaterials in gelatin-Real time PCR method2010-09-26发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2011-05-01实施
本标准由中华人民共和国农业部提出。前言
本标由全国蕾牧业标准化技术委员会归口。本标准越草单位：中国检验检疫科学研究院。GB/I25165—2010
本标准主要起草人：陈颗、是亚君,袁飞、王晶、徐宝桑、张舒亚、杨海荣，王斌、赵勇胜。1
1范围
明胶中牛、羊、猪源性成分的定性检测方法实时荧光PCR法
本标准规定了明胶中牛、羊，猪源性成分的实时荧光PCR检测方法。本标准适用了-明胶中牛、羊,猪源性成分的定性检测。该方法的检出限为0.1%。
2规范性引用文件
CB/T 25165—2010
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是日期的引用文性，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或够订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些女件的最新版本。凡是不注目期的引用文件，其最新版本适用可本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB6783食品添加剂明胶
GB/T14699.1饲料采样
GB/T27403-2008实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。3.1
实时荧光 PCRreal timc PCR
在 PCR 反应体系中加人荧光基团,利用荧光信号的积累实时监控整个 PCR 扩增过程。3.2
Ct 值cycle threshold
每个反应管内的荧光信号达到设定的阅值时所经历的循环数。4原理
利用实时荧光PCR技术,根据不同物种的特异性基因序列对牛、羊、猪源性成分进行鉴定。利用裂解液破碎细胞,酚、三氟甲烷抽提蛋白质,异丙醇沉淀得到 DNA;以提取的 DNA 为模板进行内参照基因的实时荧光PCR检测，以确定样品DNA的挺取效率；通过特异性引物和标记荧光物质探针进行牛、辛，猪藏性成分的实时荧光PCR扩增，根据PCR扩增反应中每一·个循环产物荧光信号的强判定，实现对明胶中牛、羊,猪源性成分的定性分析。5检测用引物和探针
内参照引物探针序列及牛、羊、猪特异性物探针序列见表1。1
GB/T25165--2010
内参照 5'端引物
内疼照3端引物
内参照探针
牛5'端引物
牛3'引物
牛操针
羊5'增引物
羊端引物
羊擦针
猪5引物
猪3'嘴引物
猪探针
6试剂
表 1检测用引物和探针
5'-CCTGAGAAACGGCTACCAT-3'
5'-CGTGTCAGGATTGGGTAAT-3'
S'-(FAM)-TGCGCGCCTGCTGCCTTCCT-(TAMRA)-35'-CCGATGGATGTGTTCAGAGCT3\
5'-GCCAAATGTUTGGGTGTAGATACC35'-(FAM)-TGGGCTTTAGGGCTTCCGAATGTGAA-(TAMRA)-35'-ACACAACTTETAUCACAACCC-3'
5'AAACAATGAGGGTAACGAGGG-3'
5'(FAM)-ACACCGAAACAAAATACTCCTTGAGAAACA-CTAMRA)-35'-TTTGTGCATGACTGCGTCAAC-3
S'-CTTGGTGGTCGTGGTCACTGT-3
5'- (FAM)-CACCGTCAAGCAGC (NFQ)(MGB)-3'萃酚(Tris饱和,pH8.0）、三氯甲烷、异戊醇、无水乙醇异丙醇、70%乙醇。除另有规定外，所有试剂均为分析纯。实验用水符合GB/T6682中一毁水的要求。7配制溶液
7. 1裂解
目的基因
真核生呦
18STRNA基因
生长素素基因
线粒体细胞色
b基因
脱蛋白基固
成分包括：2%（质量浓度）CTAB（cetyltrithylammoniumhromide，十六烷基三甲基溴化铵），10o mmol/I. Tris（tris hydroxymethyl aminomethanc,三羟甲基氢基 甲 烷), 1.4 mol/l. NaCl,20mmol/LEDTA（ethylenediaminetetraaceticacid,乙二胺四乙酸），用HCt谢至pH8.07.2 实时荧光 PCR 反应混合液
12. 5 μL 反应体系包括: 1 U~2 U(Unit,酶学单位)的 Taa 酶、1XPCR buffer,2. 5 mmnl/1. ~4. 0 mmol/L的 Mg2+,0. 2 U~1 U 的 UNG 酶、0. 2 mmol/L 的 d(A,C, G) TPs、0. 2 mmol/L. ~0.4mmol/LdLTP40o nmol/LROX染料(某些荧光PCR仪不需要ROX校正)。8仅器设备
8.1 实时荧光 PCR仪。
8.2恒温水浴锅。
8.3离心机：离心力不小于3000g。8.4微量移液器;0.5 μL~10 μL,10 μL~100 μL,20 μ1~200 μL,200 μL-~1 000 μL,日,5核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。8.6 pH计。
天平感量0.01g。
9样品采集
按照GB6783对食用明胶采样，按照GB/T14699.1对间料明胶采样,将实验样品粉辟，充分混合均勾后待用。
10检验步
10. 1 DNA 提取
GB/T25165—2010
称取样品500mg于50mL离心管中，加人5mL裂解液，室温过夜后登于65℃恒温糖中温育1h~2h，取出后迅速加人与裂解液等体积的室退前-三氧甲烷-异戊醇(25：24：1)（注意：如果样品因温度下降凝固而无法状得上清，可将样品再次放人65℃恒温箱中使其重新液化），题倒混，室温下12000g离心10min，转移上清至另一灭菌的心管中，如入等体积的三氯甲烷-异醇（24：1)，颠例混匀，室温下12000g离心10min，转移上消至另一灭菌的离心管中，加人0.8倍异丙醇或2倍体积的预冷无水乙酪混匀，一20放置0.5h1h，4℃下12000g离心10min~15min，弃.上清，用70%乙醇选涤沉淀一次，4℃下12000g离心10min，弃上清，室温下晾干。加人50μL双然水，溶解沉淀，一20 芒保存。
也可用等效DVA提取试剂盒提取模板DNA。DNA提取过程中以水代替样品设置提取空白对照,并置于每个提取系列中的最后。10.2实时荧光PCR扩增
反应体系的体积为 25 μL,体系组成见表 2。衰 2实时荧光PCR检测反应体系组成试剂名称
反应混合液
5'端引物
3'端4物
双蒸水
好备液铱度
10 μl/L
10 gmol/1
10 μutnol/L
加人PCR反应体系的体积/μL
补足至总体积为25
实时荧光PCR反应条件随仪器不向略有改变，一般为：50℃2minz55℃10min;95℃15s,60℃1 min 45 个循环。
检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和提取空自对照。用分别含牛、羊，猪成分的样品作阳性对照，用不含牛，羊,猪成分的样品作阴性对照。样品设3个重复，对照设2个重复，以Ct平均值作为最终结果。11结果判定
11.1PCR有效性判定
空白对照：无FAM荧光信号，相应Ct值>40.0。阴性对照：无FAM荧光信号，相放Ct值>40.0。阳性对照：有FAM荧光信号，且FAM证道出现明显的扩增曲线，Ct值≤36.0。否则判定为PCR无效。
T1.2DNA提取有效性判定
在同时进行的阴性、阳性、空占对照实验结果正常的情况下，被检测样品应有FAM荧光信号检出：且FAM通道出现明显的扩增曲线，Ct值≤40.0。否则DNA提取无效，应重新提取DNA，直至Ct值≤40.011.3检谢结果判定
在符合11.1和11.2的情说下，使用牛，羊、猪特异性引物和探针对检样品进行检测GB/T25165—2010bzxz.net
如有FAM荧光检出，且Ct值≤36.0，则判定样品含有相应的动物源性成分：如Ct值>40.0,则判定为不含相应的动物源性成分；如36.0检测过程中防止交叉亏染的措施按照GB/T27403·2008中附录D的规定执行。
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