GB/T 25168-2010
基本信息
标准号： GB/T 25168-2010
中文名称：畜禽cDNA 文库构建与保存技术规程
标准类别：国家标准(GB)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
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标准简介
GB/T 25168-2010 畜禽cDNA 文库构建与保存技术规程
GB/T25168-2010
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标准内容
ICS 65.020,30
中华人民共和国国家标准
GB/T 25168—2010
畜禽cDNA文库构建与保存技术规程Technical regulation of farm animals cDNA library construction and preservation2010-09-26 发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2011-03-01实施
本标准由中华人民共和国农业部提出。前
本标准由全国畜牧业标准化技术委员会（SAC/TC274)归口。本标准起草单位：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所。本标准主要起草人：马月辉,关伟军、陆游蜂、李向臣、修春玲、余露,刘鹏。GB/T25168—-2010www.bzxz.net
1范围
畜禽cDNA文库构建与保存技术规程本标规定了畜食 cDNA文库构建方法本标准适用于猪、牛，羊，马、驴、鸡、鸭、鹅等畜食 cDNA文库构建与保存。2.规范性引用文件
GB/T 25168--2010
下列文件中的余款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的惨改单（不包括勤误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义
下列术语和定义适于本标准。
cDNAcomplcmentarydeoxyribonuclelc acid以成熟mRNA为模板，在反转录酶的作用下合成的eDNA链。3.2
cDNA文库DNAlibrary
将处于特定发育阶段真核生物体的特定器官或组织中提取的总RNA，经过反转录等一系列的型化反应合成双链cDNA群体后，再插入到适当的载体上，经转化寄主菌株构成特定的cDNA克隆群体。3.3
嘉核苷酸oligonucleotide
一类！有20个以下碱基对的短链核首酸的总称，带用作探针确定DNA或RNA的结构，3.4
噬菌斑plaque
被噗菌体感染的细菌所释放的子代噬菌体，会继续感染周函的细胞，致使在琼脂平板上生长的菌苔中有大量的细胞发生裂解，形成的透明区域。4试剂及溶液配制
除另有规定外试剂为分折纯或生化试剂。实验用水符合GB/T6682一级用水的要求。4.1集碳酸二乙酯(diethypyrocarbonste,DEPC)处理水在1000mL去离子水中加人1ml.DEPC,37℃静置12h,高压灭菌(120℃30min）。4.22mol/LMgsO,
称取246.50gMgSO.-HaO,加400rnL双蒸水（doubledistilledH.0,ddHzC))溶解后，定容到500 ml+高压灭菌。
4.310mmol/LMgSO
量取1 mL 2 mol/I. MgS0,加 ddH,0 定容到 200 mL,高压灭菡,30 min。4. 41 mol/L Tris-Cl(pH7.5)
称取121,14gTris,碱溶于800mLddH.O中，调pH至7.5,定容到1L高压灭菌。4. 5 SM 缓冲液
称取5.80gNaCI、2.00gMgSO。-7H.0,量取50mL1mal/LTris-Cl(pH7.5)和5mL2%(质GB/T 25168—2010
量浓度)期胶,定容到 1 L,高压灭菌。4. 65 × 一链缓冲液
250 mmol/L Tris500 mmol/L Tris-Cl(pH7,8),100 mmol/L MgCl.100 mmol/L 二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT)，o,5 mg/mL血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)。4. 8LB 液体培养基
:取 10.00 g NaC1.10, 00 g细菌培养用胰蛋白陈和 5, 00 g 细菌培养用酵母提取物加 1 L ddH.0 溶解后,高压灭菌。
4. 9 LB 固体培养基
取 10. 00 多 NaCl.10. 00 多细菌培养用胰蛋白陈、5. 00 g 细菌培养用薛母搓取物和 20. 00 区 细菌培养用琼脂加1LddH,O溶解后，高压灭菌。4.10LB顶层培养基
将 0. 70 g琼脂糖加人 100 mL LB液体培养基中,高压炎菌。4.1120%麦芽糖
取 20. 00 ε麦芽糖济于 100 mL. ddH,0 中,过滤除荫。5主要仪器、设备
水溶锅、电泳仪、电泳槽、电子天平、电热恒温鼓风T燥箱、培养箱、PCR扩增仪、超纯水仪，一80C低温冰箱、凝胶自动成像分析系统和低温离心机等。6cDNA文库构建
6. 1 样品采集
畜禽机体的组织可作为构建cDNA文库的实验材料。将新鲜离体的组织样品迅速投放到液氮中，或剪切成1mm”大小的组织碎块后放入RVA保存液中。6. 2 总 RNA 提取
使用 TRIzal 法提取畜禽组织的总 RNA。在不断填充液氮的研钵中将 30 tig~100 n)g的组织样品磨碎，加人1mLTrizol（含有酚，异硫氰酸胍，8-羟基喹嘛和巯基乙醇的单相液），混后移至经DFPC处理水没泡过的离心管中,静置 5 min。加入 200 μI 三氯甲烷,混匀,静置 2 min～3 min,4 ℃下，13200g离心15min。移上清至另一离心管中，加人400μL异丙醇，混匀后静置10min，4℃下，13 200g离心10 min。弃上清,用 DEPC斑理水配制的 75%乙醇洗漆沉淀2次+室温静置 5 min~10 min，晾T后用 50 μI.--100 μL.的 DEPC 处理水溶解沉淀后用 1%变性琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖0.3g.DEPC处理水21.6mL,10×Mops3mL.37%甲醛5.4mL,核酸显示剂2μI.~3μI.)检RNA质量，于一80℃冰箱中保存。
6. 3cINA 合成
6.3. 1DNA 第一链合成
采用 5 末端 RNA 转录子转换机制(switching merhanism at 5 end of the RNA tranacript+SMARI>技术合成全长cDNA双链。首先取一PCR管分别加人0.05～1.0μR总RNA样品、1,0 μL 10 μmol/L经过修饰的 (Oligo(dG)的裹核苷酸和 l. 0 μL 10 mmol/L经过修饰的 Oligo(dT)3引物,添加 DEPC处理水使总体积达到 5. 0 μL,混匀,72 ℃下放置 2 min,冰裕 2 min。然后,分别加人2.0μL5×链缓冲液、1.0μL20mmol/LDTT、1.0μL10mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸（deoxyribo-nucleoside triphosphate,dNTP)和 l.0 uL 200 U/μuL Primergerip反转录醇,混匀,42 下效置1 h冰浴2min终止反应后进行下一步操作或一20下短期保存6. 3, 2cDVA 第二链的合成
取一 PCR 管分判加人 2, 0 μL --链 cDNA,80 μL ddH,0、10 μL 10× Ex taα 缓冲被,2. 0 μL2
GB/T25168—2010
2. 5 mmal/L 50×dNTP,2. 0 μL 10 μmol/L 5'引[物、2. 0 μL 10 μmol/L 经过修饰的 Oligo(dT)3'引物和 2. 0 μL 5 U/uL Ex tag 酶,总体积为 100 μL,混勾,95 预变性 25 s 后,95 t变性 25 $,68 C退火延伸 6 min,共 21 个循环。用 1. 1%琼脂糖对 5. 0 μL PCR 产物进行电泳检测,双链 cDNA 的分范围在0, 1 kb~~4. 0 kb 之间。
引缨序列为：
5'引物序列5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACGGCCGGG-33'引物序列5'-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30N-,N-3(N=A,G,C或 T,N-1= A,G或C)
6. 4 cDNA 的纯化、醇切与分离6. 4. 1 cDNA 的纯化
取—PCR管分别加50μL2.0官3.0μg双链cDNA、2.0μL20μ名/μL蛋白酶K，混勾，45*C下放置 20 min。然后加,人 50 μL ddH,0 和 100 μL苯酚-三氯甲烷-异戊醇(25:24 :1),混句,13 200g离心5min。移上清至另一离心管中，加入100μL三氛甲烷-异戊醇（24：1)，混句，13200g离心5min。移上清至另一离心管中,分别加人10μI.3mol/L乙酸钠（pH4.8）,1.3μL20 μg/uL肝糖元,260 μL95%乙醇,13200g离心20min。弃上清,用100μL 80%乙醇洗涤沉淀后于燥 1.0 min+然后加人79μLddH,O溶解沉凝。
6. 4.2cDNA 的酶切
取—PCR管分别加人79μL双链cDNA，10μL10×SfI缓冲液、10μ20U/μLSI内切酶和1.0 μL 100XBSA，总体积为100μL,混勾,50 ℃下放置 2h。加2.0μI.1%的二甲萍胺指示剂,混匀。6.4.3CDNA的分离
重悬分离杜内容物，自然滴尽柱中溶剂，加人700L柱缓冲液，滴尽。加入100酶切产物，滴尽。加入 100 μL柱缓冲液，滴尽，加入 600 μL柱缓种液,用16 支离心管分别逐滴收集，每管一滴。每管取3.0μI.样品，用1.1%琼脂糖凝胶进行片段大小检测。收集300bp以上的cDNA片段于--离心管中,分别加人1/10体积3mol/L乙钠（pH4.8),1.3μL20m/mI.肝糖元和2.5体积95%乙醇，视勾，一20℃下沉淀12h。4℃下,13200g离心20min，弃上清，下燥10min,7.0μl.daHz0落解沉淀，混匀，一20 ℃保存。
6. 5cDNA 片般与载体的连接
取—PCR管分别加入100ng的cDNA，1.0gL500ng/L>TripiEx2载体、0.5μL10X×DNA进接缓冲液,0.5 μL 10 mmol/l. 三磷酸腺苷(adenosine-triphosphate,ATP),0.5 μL 400 U/μL T1 DNA连接酶，加ddH：0使总体积达到5.0μl，混匀，16℃下连接12h。6. 6CDNA 重组体的包装
解炼包装蛋白抽提物，取10μL，加人4.0I.连接产物，混匀，22℃下包装2h后加人500μISM缓冲液和20μL三氯甲烷，混勾。进行未扩增文库满度测定或4℃保存。7文库的扩增与保存
在含 10 mtmnol/L MgSU4、终浓度为 0. 2%麦芽糖的 1.B体培养基中培养 VCS257菌,使细菌 OI%oc值为 2. 0,1 000g 离心 10 min+然后用 10 mmpl/L MgS0。重细胞,调 0Dc值至 4,0。分别在 20 个离心管中加入500的菌液和足够形成6.0×10个~7.0×10*个曦菌班的稀释包装液，37℃放置15min后加到 3 mL LB 顶层培养基中,混匀+立即阈人 LB琼脂平板中,涂勾,37 ℃放置 6 h~18 h,直至噬菌班相互接触后,每个平板上再加 12 mL SM缓冲液,4 C放置 12 h 后,50 r/min,37 C振药培养 1 h。最后将噬菌体裕解物移至 50 ml.离心管中,加入 10 ml,三氯甲烷,混勾,2 000g 离心 10 min,再将,上猜液转移到另一商心管，加二甲基亚碱(dimethylsulfoxideDMSO)至终浓度为7%后分装，一70它长期保存。
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GB/T 25168—2010
畜禽cDNA文库构建与保存技术规程Technical regulation of farm animals cDNA library construction and preservation2010-09-26 发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2011-03-01实施
本标准由中华人民共和国农业部提出。前
本标准由全国畜牧业标准化技术委员会（SAC/TC274)归口。本标准起草单位：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所。本标准主要起草人：马月辉,关伟军、陆游蜂、李向臣、修春玲、余露,刘鹏。GB/T25168—-2010www.bzxz.net
1范围
畜禽cDNA文库构建与保存技术规程本标规定了畜食 cDNA文库构建方法本标准适用于猪、牛，羊，马、驴、鸡、鸭、鹅等畜食 cDNA文库构建与保存。2.规范性引用文件
GB/T 25168--2010
下列文件中的余款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的惨改单（不包括勤误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义
下列术语和定义适于本标准。
cDNAcomplcmentarydeoxyribonuclelc acid以成熟mRNA为模板，在反转录酶的作用下合成的eDNA链。3.2
cDNA文库DNAlibrary
将处于特定发育阶段真核生物体的特定器官或组织中提取的总RNA，经过反转录等一系列的型化反应合成双链cDNA群体后，再插入到适当的载体上，经转化寄主菌株构成特定的cDNA克隆群体。3.3
嘉核苷酸oligonucleotide
一类！有20个以下碱基对的短链核首酸的总称，带用作探针确定DNA或RNA的结构，3.4
噬菌斑plaque
被噗菌体感染的细菌所释放的子代噬菌体，会继续感染周函的细胞，致使在琼脂平板上生长的菌苔中有大量的细胞发生裂解，形成的透明区域。4试剂及溶液配制
除另有规定外试剂为分折纯或生化试剂。实验用水符合GB/T6682一级用水的要求。4.1集碳酸二乙酯(diethypyrocarbonste,DEPC)处理水在1000mL去离子水中加人1ml.DEPC,37℃静置12h,高压灭菌(120℃30min）。4.22mol/LMgsO,
称取246.50gMgSO.-HaO,加400rnL双蒸水（doubledistilledH.0,ddHzC))溶解后，定容到500 ml+高压灭菌。
4.310mmol/LMgSO
量取1 mL 2 mol/I. MgS0,加 ddH,0 定容到 200 mL,高压灭菡,30 min。4. 41 mol/L Tris-Cl(pH7.5)
称取121,14gTris,碱溶于800mLddH.O中，调pH至7.5,定容到1L高压灭菌。4. 5 SM 缓冲液
称取5.80gNaCI、2.00gMgSO。-7H.0,量取50mL1mal/LTris-Cl(pH7.5)和5mL2%(质GB/T 25168—2010
量浓度)期胶,定容到 1 L,高压灭菌。4. 65 × 一链缓冲液
250 mmol/L Tris
:取 10.00 g NaC1.10, 00 g细菌培养用胰蛋白陈和 5, 00 g 细菌培养用酵母提取物加 1 L ddH.0 溶解后,高压灭菌。
4. 9 LB 固体培养基
取 10. 00 多 NaCl.10. 00 多细菌培养用胰蛋白陈、5. 00 g 细菌培养用薛母搓取物和 20. 00 区 细菌培养用琼脂加1LddH,O溶解后，高压灭菌。4.10LB顶层培养基
将 0. 70 g琼脂糖加人 100 mL LB液体培养基中,高压炎菌。4.1120%麦芽糖
取 20. 00 ε麦芽糖济于 100 mL. ddH,0 中,过滤除荫。5主要仪器、设备
水溶锅、电泳仪、电泳槽、电子天平、电热恒温鼓风T燥箱、培养箱、PCR扩增仪、超纯水仪，一80C低温冰箱、凝胶自动成像分析系统和低温离心机等。6cDNA文库构建
6. 1 样品采集
畜禽机体的组织可作为构建cDNA文库的实验材料。将新鲜离体的组织样品迅速投放到液氮中，或剪切成1mm”大小的组织碎块后放入RVA保存液中。6. 2 总 RNA 提取
使用 TRIzal 法提取畜禽组织的总 RNA。在不断填充液氮的研钵中将 30 tig~100 n)g的组织样品磨碎，加人1mLTrizol（含有酚，异硫氰酸胍，8-羟基喹嘛和巯基乙醇的单相液），混后移至经DFPC处理水没泡过的离心管中,静置 5 min。加入 200 μI 三氯甲烷,混匀,静置 2 min～3 min,4 ℃下，13200g离心15min。移上清至另一离心管中，加人400μL异丙醇，混匀后静置10min，4℃下，13 200g离心10 min。弃上清,用 DEPC斑理水配制的 75%乙醇洗漆沉淀2次+室温静置 5 min~10 min，晾T后用 50 μI.--100 μL.的 DEPC 处理水溶解沉淀后用 1%变性琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖0.3g.DEPC处理水21.6mL,10×Mops3mL.37%甲醛5.4mL,核酸显示剂2μI.~3μI.)检RNA质量，于一80℃冰箱中保存。
6. 3cINA 合成
6.3. 1DNA 第一链合成
采用 5 末端 RNA 转录子转换机制(switching merhanism at 5 end of the RNA tranacript+SMARI>技术合成全长cDNA双链。首先取一PCR管分别加人0.05～1.0μR总RNA样品、1,0 μL 10 μmol/L经过修饰的 (Oligo(dG)的裹核苷酸和 l. 0 μL 10 mmol/L经过修饰的 Oligo(dT)3引物,添加 DEPC处理水使总体积达到 5. 0 μL,混匀,72 ℃下放置 2 min,冰裕 2 min。然后,分别加人2.0μL5×链缓冲液、1.0μL20mmol/LDTT、1.0μL10mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸（deoxyribo-nucleoside triphosphate,dNTP)和 l.0 uL 200 U/μuL Primergerip反转录醇,混匀,42 下效置1 h冰浴2min终止反应后进行下一步操作或一20下短期保存6. 3, 2cDVA 第二链的合成
取一 PCR 管分判加人 2, 0 μL --链 cDNA,80 μL ddH,0、10 μL 10× Ex taα 缓冲被,2. 0 μL2
GB/T25168—2010
2. 5 mmal/L 50×dNTP,2. 0 μL 10 μmol/L 5'引[物、2. 0 μL 10 μmol/L 经过修饰的 Oligo(dT)3'引物和 2. 0 μL 5 U/uL Ex tag 酶,总体积为 100 μL,混勾,95 预变性 25 s 后,95 t变性 25 $,68 C退火延伸 6 min,共 21 个循环。用 1. 1%琼脂糖对 5. 0 μL PCR 产物进行电泳检测,双链 cDNA 的分范围在0, 1 kb~~4. 0 kb 之间。
引缨序列为：
5'引物序列5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACGGCCGGG-33'引物序列5'-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30N-,N-3(N=A,G,C或 T,N-1= A,G或C)
6. 4 cDNA 的纯化、醇切与分离6. 4. 1 cDNA 的纯化
取—PCR管分别加50μL2.0官3.0μg双链cDNA、2.0μL20μ名/μL蛋白酶K，混勾，45*C下放置 20 min。然后加,人 50 μL ddH,0 和 100 μL苯酚-三氯甲烷-异戊醇(25:24 :1),混句,13 200g离心5min。移上清至另一离心管中，加入100μL三氛甲烷-异戊醇（24：1)，混句，13200g离心5min。移上清至另一离心管中,分别加人10μI.3mol/L乙酸钠（pH4.8）,1.3μL20 μg/uL肝糖元,260 μL95%乙醇,13200g离心20min。弃上清,用100μL 80%乙醇洗涤沉淀后于燥 1.0 min+然后加人79μLddH,O溶解沉凝。
6. 4.2cDNA 的酶切
取—PCR管分别加人79μL双链cDNA，10μL10×SfI缓冲液、10μ20U/μLSI内切酶和1.0 μL 100XBSA，总体积为100μL,混勾,50 ℃下放置 2h。加2.0μI.1%的二甲萍胺指示剂,混匀。6.4.3CDNA的分离
重悬分离杜内容物，自然滴尽柱中溶剂，加人700L柱缓冲液，滴尽。加入100酶切产物，滴尽。加入 100 μL柱缓冲液，滴尽，加入 600 μL柱缓种液,用16 支离心管分别逐滴收集，每管一滴。每管取3.0μI.样品，用1.1%琼脂糖凝胶进行片段大小检测。收集300bp以上的cDNA片段于--离心管中,分别加人1/10体积3mol/L乙钠（pH4.8),1.3μL20m/mI.肝糖元和2.5体积95%乙醇，视勾，一20℃下沉淀12h。4℃下,13200g离心20min，弃上清，下燥10min,7.0μl.daHz0落解沉淀，混匀，一20 ℃保存。
6. 5cDNA 片般与载体的连接
取—PCR管分别加入100ng的cDNA，1.0gL500ng/L>TripiEx2载体、0.5μL10X×DNA进接缓冲液,0.5 μL 10 mmol/l. 三磷酸腺苷(adenosine-triphosphate,ATP),0.5 μL 400 U/μL T1 DNA连接酶，加ddH：0使总体积达到5.0μl，混匀，16℃下连接12h。6. 6CDNA 重组体的包装
解炼包装蛋白抽提物，取10μL，加人4.0I.连接产物，混匀，22℃下包装2h后加人500μISM缓冲液和20μL三氯甲烷，混勾。进行未扩增文库满度测定或4℃保存。7文库的扩增与保存
在含 10 mtmnol/L MgSU4、终浓度为 0. 2%麦芽糖的 1.B体培养基中培养 VCS257菌,使细菌 OI%oc值为 2. 0,1 000g 离心 10 min+然后用 10 mmpl/L MgS0。重细胞,调 0Dc值至 4,0。分别在 20 个离心管中加入500的菌液和足够形成6.0×10个~7.0×10*个曦菌班的稀释包装液，37℃放置15min后加到 3 mL LB 顶层培养基中,混匀+立即阈人 LB琼脂平板中,涂勾,37 ℃放置 6 h~18 h,直至噬菌班相互接触后,每个平板上再加 12 mL SM缓冲液,4 C放置 12 h 后,50 r/min,37 C振药培养 1 h。最后将噬菌体裕解物移至 50 ml.离心管中,加入 10 ml,三氯甲烷,混勾,2 000g 离心 10 min,再将,上猜液转移到另一商心管，加二甲基亚碱(dimethylsulfoxideDMSO)至终浓度为7%后分装，一70它长期保存。
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