GB/T 26436-2010 禽白血病诊断技术 GB/T26436-2010 标准下载解压密码：www.bzxz.net

ICS11.220
中华人民共和国国家标准
GB/T 264362010
禽自血病诊断技术
Diagnostic techniques for avian leukosis2011-01-14发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2011-07-01实施
GB/T26436—2010
本标准的附录A、附录B、附录C、附录D、附录E、附录F为规范性附录，附录G、附录H为资料性附录。
本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SC/TC 181)归口。本标准起草单位：山东农业大学、中华人民共和国珠海出人境检验检疫局、华南农业大学。本标准主要起草人崔治中、孙淑红、赵鹏，杨索，沙才华，廖明，曹伟胜GB/T26436—2010
禽白血病病毒（avian leukosisvirusestALV)为反转录病毒科的a反转录病毒属，可诱发鸡不向组织的良性和恶性肿瘤，是鸡群中除马立克氏病病毒（MDV)和禽网状内皮增生症病毒REV>外的又一类重要的致肿瘤病毒。
离白血病是一类由ALV相关的反转录病毒引起鸡的不同组经良性和恶性肿痛病的总称。随发生肿的主要细胞成分不同，分别称之为不同名称的肿。ALV可分为A--10个亚群，其中仅A亚群、B亚样、C亚群、D亚群、E亚群、J亚群病毒与鸡相关，A亚群、B亚群、C亚群、D亚群、J亚群属外源性ALV,与禽白血病的不间类型肿瘤发病相关。E亚群病萨基因组可完整地整合进感染鸡的染色体基因组并稳定地遗传下去，也可从中再复制出传染性病毒颗粒，因而称之为内源性病毒。此外，在一些鸡的染色体的不而部位，还可能带有一-些ALV的基因组片段。E亚群ALV的致病性很低或没有致病性，不扁于净化对象，但狠多鸡群中包括…无特定病原（SPF)鸡群都可能带有E亚群内源性ALV，它的感染不会给鸡群带来不良影响：但会干扰检测。日前，该病对我国养鸡业的危苦很大。在国际种禽贸易中，外源性白血病病毒感染是最主婴的检测对象之一
1范围
禽自血病诊断技术
本标准规定了病料中ALV特异血清抗体和外源性ALV的检测方法。本标推适用于判断鸡群或病料中是否有外源性ALV感染。2临床症状和病理变化
GB/T26436-2010
A主要起感染鸡在性成熟前后发生肿痛死产，感染率和发病死亡率高低不等，死广萃最高口达20%。一些鸡感染后虽不发生肿瘤，似可造成产蛋性能下降其至免疫抑制。淋巴样白血病是最为带见的经典型白血病肿瘤,肿瘤可见子肝,脾,法氏囊、肾,肺、性腺,心,骨髓等器官组织，肿瘤可表现为较大的结节状(块状或米粒状)，或弥漫性分布细小结节。肿瘤结节的大小和数盘差异很大，表面平滑，切开后是灰白色至奶酪色，但很少有坏死区。在成红细胞性白血病，成髓性细胞白血病、髓细胞白血病中，多使肝、脾、肾呈弥没性增大。J亚群ALV感染主要诱发髓细胞样肿痹，它最常见的特征性变化主要为肝脾肿人或布满无数的针尖、针头大小的白色增生性肿瘤结节：在一些病例中,还可能在胸骨和肋骨表面出现肿瘤结节。单纯苏木精伊红染色（H.E染色)的病理组织切片观察在诊断上有一定参考意义。在表现为淋巴样细胞肿瘤结节时，要注意与马立克氏病病毒（MIDV)和离网状内皮增生症病毒（REV)诱发的肿瘤相区别：在表现为髓样细胞瘤时，既要与REV诱发的类似肿韬细胞相区别，也要与嗜中性白细胞浸润性炎症指区别，如鸡皮型肝炎病毒感莱引趣的肝局部炎症。最繁的鉴别诊断以肿痛组织中的病毒抗原检测或病毒分离鉴定为最可靠依据，3病毒的分离培养,检测和鉴定
3.1试剂和仪器
3. 1. 1试剂
DMEM液体培养基(pH7.2)、0.25%胰酶、磷盐缓冲液(0.01 mol/LPBS,pH7.2)、抽提缓冲液、青霉素（10万U/mI.).链霉素（10万U/mL)、抗ALV单抗、抗ALV单因子鸡血清、异硫氰酸荧光素(FITC)标记的山羊抗小鼠IgG抗体AIV-p27抗原酶联免疫吸附试验（ELISA)检测试剂盒、聚合酶链反应（FCR)试剂RT-PCR试剂、生理盐水（0.9%氧化钠），无水乙醇（分析纯）、丙两酮（分析纯）、甘油（分析纯）,75%酒精、碘酒细胞生长液（含有5%胎牛血清或小牛血清的DMEM液体培养基）、细胞维持液【含有1%眙牛血清或小牛血清的DMEM液体培养基）、大肠杆菌（TG1),蛋白酶K,70%冷乙醇乙酸销（分析纯）.三氯甲烷（分析纯）、异戊醇（分析纯）、异丙醇（分析纯）、10×加样缓冲，琼瞻糖、DL2000DNAMarker，TAE电泳缓冲液、氯化钙(0.1mol/L）、氨卡青睾素（10μg/μL）、双蒸水、LB液体培养基、TE缓冲液、RNasc、细胞裂解液、0.1%的DEPC(焦碳酸乙二酯)水等（除特殊说明外上述试剂均为分析纯）。
3. 1.2仅器
锥形瓶、荧光整微镜、恒温培养箱，冰冻台式离心机（212000 1/min）、一20℃冰箱、一80 七冰箱、1
GB/T 26436—2010
Eppendarf管（离心管）、棉棒、载玻片、盖玻片、细胞培养平血、37℃数显恒溢水浴锅、37℃摇床、96孔培养板,SPF隔离器、外光凝胶成像分析仪，微量移液器，低温恒温水槽（16七）、吸水纸。3. 2分离病霉用细胞
3.2.1鸡胚成纤维细胞(CEF)
鸡胚成纤维细胞制备方法见附录A3.2.2鸡胚成纤雄细胞自发永生株(DF1)细胞DF1 细胞培养基制备方法见附录 HB3.3病料的采集与处理
3.3. 1 全血、血清或血浆
取疑似病鸡的全血，带有白血细胞的血浆或血清，无菌接种于长成单层的CEF或DF1,置于含5%二氧化碳的37 C恒温培养箱中培养。3. 3. 2脏器
采集疑似病鸡的脾、肝脏、肾脏，按脏器质的1倍一2倍加入灭菌生理盐水（含育睡素和链霉素各1000[U/mL>研磨，至成匀浆液。将悬液移至离心管中充分播振后，4℃，10000r/min离心5min，收集上消液。按3.4.1.1中的方法接种培养或一70C保存备用。3,3.3短苗样品
疫苗样品处理后接种CEF培养扩增病毒。但为了鉴别是否是外源性ALV，应接种DFI细胞或其他抗E亚群白病鸡细胞(C/E)鸡来源的细胞。3.3.4咽喉、泄殖腔棉拭子
取咽喉栉拭子时，将棉拭子深人喉头口及上颈裂来回刮3次～5次取瞬喉分泌液；取泄殖腔棉拭子时，将棉拭子深人泄殖腔转3周并活取少量粪便；将棉拭了头并效入盛有1.5mL磷酸盐缓冲液的无菌离心管中（含青霉素和链毒素各1000[U/mL），盖上管盖并编号，10000r/min离心5min后取上清备用。
3.4病毒的分离培养与监定
3.4.1病毒的分离培养
3.4.1.1接种培养：病料接种细胞单层后，置于37℃培养箱中培养2h。然后吸去细胞生长液，换入细胞维持液，继续培养5d～7d。
3.4.1.2细胞传代：将3.4.1.1培养的细胞传代于加有盖玻片的平血中，培养5d-7d3.4.2病毒的鉴定
3.4.2.1间接免疫荧光抗体反应(IFA)3. 4. 2. 1. 1固定
将盖玻片上的单层细胞，在白然干燥后滴加丙-乙醇（6：4）混合液室温固定5min，待其白然干2
爆，用于 IFA,或置于一20 亡保存备用。设未感染的细胞单层为阴性对照。3.4.2.1.2加第一抗体
GB/T 26436—2010
用0.01 ol/L磷酸盐經冲液(pH7.4)将单克降抗体如抗 ALV-J亚群特异性单克隆抗体)或抗ALV 单因子鸡血清(抗 ALV单因子璐血清的制备见附录 C)稀释到工作浓度,在 37 水浴箱作用40 min，然后用磷酸盐缓冲液洗涤3次。3.4.2.1.3加FITC标记二抗
按商品说明书用磷酸盐缓冲液稀释FITC标记的山羊抗小鼠IgG抗体或山羊抗鸡IgY抗体（当第一抗体为ALV特异性单克隆抗体，选用F1TC标记的山羊抗小鼠IgG抗体作为第一抗体；当第一抗体为鸡抗ALV单因子面清，则选用FITC标记的山羊抗鸡IgY抗体作为第二抗体》37℃水裕箱作用40 tmin,用磷酸盐缓冲液洗漆 3 次。3.4.2.1.4加甘油
滴加少量50%甘油磷酸盐毁冲液于载玻片上，将盖玻片上的样品倒扣其上。在荧光显微镜下观察。
3.4.2.1.5结果观寒与判定
被感染的CEF细胞内呈现亮绿色荧光，周围未被感染的细胞不被着色或颜色很嵌。在放大200×~400×时，可见被感染细胞胞浆着色，判为ALV阳性，无亮绿色荧光者判为阴性，3.4.2.2ALV-p27抗原ELISA检测
3,4.2,2.1抗原样本制备
将病料同 3. 4. 1. 1 和 3. 4. 1. 2 所述方法接种细胞,培养 7 d~14 d 后取 上清液直接检测;也可取细胞塔着物炼融后检测；或用从泄殖腔采巢的棉拭子。3. 4. 2.2. 2P27 抗原 ELISA检测ALV-p27抗原可用商品试剂盒检测，对不同来源的样品，按厂家的说明书操作，当样本在DF1细胞或CEF(C/E品系)上检测出 ALV-p27抗原时,判为外源性 ALV阳性，否则判为性。直接用泄殖腔棉拭了样品检测出 p27,说明有ALV，但不能严格区分外源性或内源性。3.5ALY亚群鉴定
3.5.1利用J亚群ALV特异性单克隆抗体进行IFA检测，可以鉴定J亚群ALV,但不能鉴别其他ALV亚群如A亚群.B亚群.C亚群、D亚群。3.5.2对分离到的病毒用 RT-PCR(上清液中的游离病毒)或 PCR(细胞中的前病毒 cDVA)扩增和克隆囊膜蛋白 gp85 基因,测序后与基因序列数据库(GcncBank)中的已知 A 亚群、B 亚群,C 亚群,D 亚群的区P85基因序列做同源性比较，即可对病董进行分群。ALV病毒分群方法见附录D。3. 6 荧光定量 PCR 扩增 ALV-J该方法适用于鸡群的检疫或ALV-J感染的净化，可在较短时间内完成大星样品的特异性检测。血浆或泄殖腔棉战子样品可直接用于检测,见附录E。3
GB/I26436--2010
4血清特异性抗体的检测
4.1仅器和试剂
4.1.1试剂：磷酸盐缓冲液洗液、白血病抗体ELISA检测试剂盒，FITC标记的山羊抗鸡IgY抗体、甘油。
2仪器：酶标仪，荧光显微镜，37七恒温培养箱。41.2
4.2样品的采袭
样品的采集见3.3。
4.3抗体的检测
4. 3. 1ELISA检测
可选用禽白血病A亚群、B亚群及J亚群抗体ELISA检测试剂盆，严格按商品提供的说明书操作和判定。
2IFA检测
4.3.2.1抗原
抗原制备方法见附录F。
4. 3. 2.2操作步骤
在相应的盖玻片上或抗原孔中加人用磷酸盐缓冲液（1：50)稀释的待检鸡血清,在37下作用40min，用磷酸盐缓冲疲洗漆三次。再加人工作浓度的FITC标记的山羊抗鸡IgY抗体(第二抗体）,在37℃作用40min，用磷酸盐缓冲液洗漆3次，加少量50%甘油磷酸盐缓冲液后在荧光显微镜下观察。4.3.2.3结果的判定
结果的判定方法同3.4.2.1.5，不论是商品鸡群还是SPF鸡群，只要检出A亚群、B亚群及丁亚群抗体阳性的鸡，就表明该群体曾经有过外性ALV感染。4
附录A
（规范性附）
0系SPF鸡胚成纤维细脑(CEF)的制备CB/T26436—2010
选择9日龄~10日龄发育良好的SPF鸡胚。先用碘酒棉再用酒精棉消毒蛋壳气室部位，无菌敢出鸡胚，去头、四肢和内脏,放人灭菌的玻璃器血内，用无血清的DMEM液洗涤胚体。用灭菌的剪剪成米粒大的小组织块，再用无血清的DMEM滋洗2次～3次，然后加0.25%胰酶溶滋（每个鸡胚药加1 mL),在 37.5℃~38.5 ℃水裕中游化10 min-~15 min。吸出胰酶溶液消化产生的悬液,再加适量的营养液(用无血清的DMEM液，加青每素，链霉素 200 IU/mL～500 IU/mL)吹打,用4层纱布滤过。取少量过滤后的细胞悬液做细胞计数，其余在1000r/min下离心5min。将细胞沉淀再混悬于细胞培养液中，制成每弯升含活细胞数约100万150万的细胞悬液，分装于培养瓶（血）中，进行培养，形成单层后备用（一般在24h内应用）。GB/T26436—2010
（规范性附录）
DF1细胞培养基配制
商品化的DMEM液pH7.2,加5%胎牛血清。青霉素、链毒素各250 IU/rnL。B.1
培养条件：37℃，5%三氧化嵌。B.2
附录c
(规范性附录）
抗 ALV单因子鸡血清的制备
GB/T264362010
选择经鉴定无任何其他潜在病毒的ALV参考株作为种毒（如经ALV-J全基因组cDNA克隆质粒DNA转染SPF鸡的CEF所产生的分子克隆化ALV),接种C/ECEF后复制和扩增病毒。病毒接种CEF维继续培养5d后，再传代一次。将传代长成单层的CEF换成含1%小牛血清的DMEM维持液，继续培养 72 h~96 h后收取上清液(通常可达到最高病毒效价),分装在离心管中,每支 1 mL,于一70 ℃冰箱保存。2 d～3 d 后,取出一支，用细胞培养液作 10 倍系列稀释后,分别接种于含有新鲜配制的 CEF单层（细胞覆盖面应70%）96孔培养板上，每个稀释度8孔，在37℃下培养6d后，弃上消液，用磷酸盐缓冲液洗一次后-加入预冷的丙酮-乙醇（64)固定。待白然干燥后，用抗ALV-J的单克隆抗体进行IFA(见3.5)，以IFA的结果来判定病感染的终点，测定其中ALV的组织细胞半数感染量（TCID）。选用 6 周龄以上 SPF 鸡,SPF 隔离器饲养。每只鸡皮下接种 1D 个 TCIDi的 ALV 恶液。4 周~6厨后采集血清。IFA抗体滴度应≥1：100。GB/T 26436—2010
D.1克隆载体和宿主菌
附录D
（规范性附录）
ALV亚群鉴定程序
商品化的PCR产物克隧载体质粒，或其他类似载体质粒，可用多种大肠杆菌作为宿主菌，如IG1等。
D.2病害模板的制备下载标准就来标准下载网
按照以下程序或商品化提取细胞DNA试剂盒的说明书提取细胞DNA。1)接种病毒的细胞经磷酸盐缓冲液洗涤 3 次,加人适量 0. 25%胰酶,37 ℃温箱中效置 5 rnin~10 min,将细胞消化吹打后收集于1,5 mL离心管中。20001/min离心收获细胞，然后加人500μL抽提缓冲液（100mmo1/L氯化钠，10mrmol/L2）2
Tris,Cl pH8,0,25 mmol/L EDTA pH8. 0,0. 5% SDS)悬浮后,加人 5 μ 蛋白酶 K(100/mL），56C水浴中消化5h。3）加入等体积的苯酚-三氯甲烷溶减（苯醛：三载烷：异戊醇一25：241)药500μ1抽提欲,将上层液体转移到另-- 1. 5 mL 离心管中,加入 1/10 体积 3 mol/L 的乙酸钠和 2 倍体积无水乙醇后，置于一20℃冷却2h或者更长时间。取出后12 0001/min离心10min泥淀DNA,弃去上清液。再小心加人70%冷乙醇轻洗DNA4
沉淀，弃去上清。
5) 经乙醇沉淀后的 DNA,空气中室温自然干燥后,溶解于 50 μL双蒸水中,即为模板 DNA。D. 3囊膜蛋白 v基因的扩增
D, 3. 1 引物
可根据口发表资料合成扩增ALV-J的前病毒DNA特异性PCR引物，本例示范引物为：正向引物：5'-CTTGCTGCCATCGAGAGGTTACT-3，相当于ALV-J原型毒株HPRS-103前病毒基因组DNA序列的第5394对~第5416对碱基。反向引物：5-AGTTGTCAGGGAATCGAC-3'相当于ALV-J原型毒抹HPRS-103前病毒基因组DNA 序列的第 78I1 对～第 7794 对基,引物用效蒸水稀释为25pmol/uL，一20℃保存备用。D. 3.2PCR
以第D.2竞中提取的细胞IDNA为模板，扩增ALV-J的衰膜蛋白基因（enb)特异性2.2kb条带，其PCR反应体系(5O L)见表 D. 1。8
双蒸水
表D.1 ALV-Jenv基因PCR反应体系组
10×塑冲液（无Mg-）成分，100mol/Tris.ClHa.0,500丑mol/L氧化钾，1%明胶氯化镁(15 mmol/L)
dNTPsc2. 5 mmol/L)
正向物（25pmal/μl)
反向物（25 prnal/μL)
IDNA 案合酶(5 U/μL)
模板 DNA(药 1GD ng/μL)
总体积
GB/T 26436—2010
体积/uL
将上述成分分别加人灭菌的PCR管中，轻轻混和均匀，离心后置于PCR扩增仅。按照以下扩增程序进行反应：
首轮裤环：95℃5min，50℃1min，72℃1min中间循环：95℃1min，50℃1min，72℃2min30，进行30个循坏72C延伸10min;4℃保存。
D. 3. 3PCR 产物 DXA 电泳
用微量移被器取 4. 5 μL PCR产物加人 0. 5 μL 的 10×进样缓冲液(0. 25%激酶蓝,0. 25%=甲苯苯胺,15为案蔗糖 400),在浓度为 0.8%的琼脂糖凝胶上进行电泳,同时在另一加样孔加入 5 xLDL2000 DNA Marker。在 TAE电泳缓冲液中,90 V电压,电泳 50 min 后于紫外光凝胶成像分析系统中观察并记录结果。
D. 3. 4 PCR 产物的回收与定量可采用商品化PCR产物回收试剂盒进行回收。将病毒 en 基因的 PCR产物在 0. 8%的琼脂糖凝胶上进行电泳,90 V 电压,电泳 50 min。1
将月的条带切制下来,置于已经称重的 1. 5 mL. 离心管中。再饮称重，计算含目的条带的胶块的质量。按每毫克加人100μLltraSalt.在55C~65℃水游锅中使琼脂糖凝胶融化。加人 5 μL Glass Milk,混匀后室温下放置 5 min。12000r/mi离心，去掉上清液。
加人1mLUltraWash洗涤沉淀。
120001/min离心，去掉上清液。再次离心，用微量移液器吸出剩余液体。干燥后,加人15 μL双蒸水,用微量移液器吹打混匀后,室温下放置5 min,12 000 1/min 离心,将上清液转移至另一离心管中。取 1 L 回收产物在 0. 8%的琼脂糖凝胶上进行电泳,另加 5 μL DL2000 DNA Marker,用以10)
估计回收 DVA 的浓度。
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